第三章农药残留分析样品制备11

农兽药残留检测•3.1概述•3.2样品制备的原理•3.3萃取•3.3.1溶剂萃取法•3.3.2固相萃取法•3.3.3固相微萃取法阳江职业技术学院生命科学与技术系3.1概述1.样品制备（samplepreparation）是将检测样品处理成适合测定的检测溶液的过程，是农药残留分析方法的重要部分一般包括步骤：（1）提取残留农药（2）浓缩提取液（3）提取液中干扰性杂质的分离净化阳江职业技术学院生命科学与技术系2.样品制备的目的使样品经处理后更适合农药残留分析仪器测定的要求，以提高分析的速度、效率、准确度、灵敏度和精密度。阳江职业技术学院生命科学与技术系3.2样品制备的原理样品制备的原理主要是利用残留农药与样品基质的物理化学特性差异，使其从对检测系统有干扰作用的样品基质中提取分离出来。化合物的极性和挥发性是指导样品制备最有用的理化特性。极性主要与化合物的溶解性及两相分配有关，如在进行液液提取、固液提取、液固提取等操作时就是利用农药的极性这一理化特性。挥发性则主要与化合物的气相分布有关，如在进行吹扫捕集提取、顶空提取等操作时就是利用农药的挥发特性。阳江职业技术学院生命科学与技术系分配定律分配定律是一个与极性及溶解性相关的概念，它是指在一对互不相溶的二相溶剂系统中，由于物质在非极性相和极性相中的溶解度不同，当达到平衡时，物质在该二相中的浓度比在一定条件下为一常数的定律KD=[A]非极性相/[A]极性相KD称为分配系数，与溶质及溶剂的性质及平衡时的温度等条件有关，而与相体积无关。阳江职业技术学院生命科学与技术系KD值越大，存在于非极性溶剂中的农药越多，越有利于用非极性溶剂向极性溶剂中提取农药，而KD值越小，则存在于极性溶剂中农药越多，越有利于用极性溶剂向非极性溶剂中提取农药。在农药残留分析样品制备中，我们常应用分配定律进行农药的提取和分离净化。阳江职业技术学院生命科学与技术系3.3萃取萃取(extraction)是指通过溶解、吸着或挥发等方式将样品中的残留农药分离出来的操作步骤，也常称为提取。由于残留农药含量甚微（痕量），提取效率的高低直接影响分析结果的准确性。萃取方案的选定主要是根据残留农药的理化特性来定，但也需要考虑试样类型、样品的组分（如脂肪、水分含量）、农药在样品中存在的形式以及最终的测定方法等因素。阳江职业技术学院生命科学与技术系3.3.1溶剂提取法溶剂提取法是根据残留农药与样品组分在不同溶剂中的溶解性差异，选用对残留农药溶解度大的溶剂，通过振荡、捣碎、或回流等适当方式将分析物从样品基质中提取出来的一种方法。是最常用、最经典的有机物提取方法，具有操作简单，不需要特殊的或昂贵的仪器设备，适应范围广等优点。阳江职业技术学院生命科学与技术系溶剂提取法包括液液提取和固液提取二种主要方式。1.液液提取液液提取(LLE,liquid-liquidextraction)是指根据分配定律，用与液体样品（一般是水）不混溶的溶剂与样品液体接触、分配、平衡，使溶于样品液体相的化合物转入提取溶剂相的过程。根据下式，当二相的体积相等时（v1=v2），如果溶质(m)存在于非极性相中的份数为p，存在于极性相中的份数为q，则KD=[A]非极性相=m·p/v1=p[A]极性相m·q/v2q阳江职业技术学院生命科学与技术系由于p值与KD值的变化趋势一致，有相同的特性，但比KD值更直观地表明了分配平衡后农药存在于非极性溶剂中的比例。例如当p＝0.1时，即表示经一次等体积液液分配将会有10％的农药存在于非极性溶剂中，而90％的农药存在于极性溶剂中。阳江职业技术学院生命科学与技术系在农药残留量分析中，p值主要用于溶剂对的选择以决定分配提取的次数。液液提取效率的高低取决于化合物与提取溶剂的亲和性（分配系数或p值）、二相的体积比和提取次数三个因素。阳江职业技术学院生命科学与技术系液液提取通常用分液漏斗进行。操作时注意事项：1.分液漏斗体积；2.分液漏斗活塞的密封性；3.加入的提取剂的量；4.振摇（摇晃→激烈振摇）。阳江职业技术学院生命科学与技术系液液萃取操作步骤溶剂体积为样品溶液的10％~30％。摇晃几次Gas放气打开活塞阳江职业技术学院生命科学与技术系激烈振摇3～5min静置分层阳江职业技术学院生命科学与技术系阳江职业技术学院生命科学与技术系阳江职业技术学院生命科学与技术系液液提取要求有较大的分配系数。通过调节溶液的pH值阻止酸性或碱性农药离子化，或通过加盐降低农药的水溶性，这样可以提高分配系数。阳江职业技术学院生命科学与技术系2.固液提取固液提取(SLE,solid-liquidextraction)是指通过溶解、扩散作用使固相物质中的化合物进入溶剂（包括水）中的过程。它主要用于固体样品（如土壤、动植物样品）残留农药的提取。阳江职业技术学院生命科学与技术系固液提取过程中，不同样品类型对溶剂的选择有很大影响。对含水量大的样品，应采用与水混溶的溶剂或混合溶剂提取；对含脂肪多的样品则用非极性或极性弱的溶剂提取；对土壤样品则用含水溶剂或混合溶剂提取。阳江职业技术学院生命科学与技术系目前较多的农药残留分析方法中对动植物组织、食品等固体样品采用与水混溶的溶剂（如丙酮、乙腈）提取，这样可以减少油脂、蜡质等非极性杂质的含量，同时有些样品提取后经加水稀释可以方便地用固相提取技术进行净化和浓缩。阳江职业技术学院生命科学与技术系固液提取常用方法：⑴.索氏提取法：用适当的提取溶剂在索氏提取器（Soxhletextractor）中连续回流提取8个小时左右，获得提取液。这一方法提取彻底，适用于匀浆法等难于提取样品中残留农药的提取，或是作为其它提取方法提取效率的参照标准。索氏提取法是许多残留农药提取的推荐方法，在农药残留分析实验室内普遍使用。阳江职业技术学院生命科学与技术系索氏提取器（下图）是1879年由德国化学家FranzvanSoxhlet设计出，其主要特点是样品与提取液分离，利用虹吸管通过回流溶剂浸渍提取，不会有溶质饱和问题，可达到完全提取的目的。但一般需时较长，要提取8h左右或以上。阳江职业技术学院生命科学与技术系使用时将样品盛装在滤纸筒中放入回流提取管内，上部接上冷凝管，下接圆底烧瓶。溶剂装在底部圆底烧瓶中，置水浴上加热。至溶剂沸点后，溶剂蒸汽从回流提取管的侧管进入冷凝管，冷凝后滴流在样品上将残留农药提取出来。待回流溶剂达到虹吸管高度后，由于虹吸作用流入底部烧瓶。如此重复多次，直至残留农药被完全提取出来。这一方法不适宜于对热不稳定农药的提取。阳江职业技术学院生命科学与技术系阳江职业技术学院生命科学与技术系阳江职业技术学院生命科学与技术系全自动索氏提取器（型号：B-111）自动取样器+溶剂自动分流器采用150℃高温加热（可用水进行抽提），测定一批样品的工作时间在2h，测定时间短，是为快速测定仪。测定分为抽提、淋洗及溶剂回收和烘干四个步骤在同一台仪器中进行。阳江职业技术学院生命科学与技术系B-811有四种抽提方法：A、标准索氏抽提法；B、索氏加热抽提法（快速法）标准索氏抽提法只有下面的样品收集烧杯可以加热，索氏加热抽提法不仅可以加热样品收集烧杯，而且还可以加热索氏抽提器内浸提的样品；阳江职业技术学院生命科学与技术系C、加热抽提法（热浸法）索氏加热抽提法的加热抽提器内浸提样品时溶剂的液面高度是可以控制的，在抽提过程中溶剂不断被冷凝下来流入索氏抽提器内。液面达到一定高度时，电磁阀打开使一定量的溶剂和浸出物流入接收杯中，阀门关闭溶剂继续冷凝下来流入索氏抽提器，这样总是保持抽提器内溶剂的量是恒定的，直到完成抽提；阳江职业技术学院生命科学与技术系D、连续抽提法；一般索氏抽提法收集的样品需要放入烘箱内烘干，而B-811在溶剂回收时向索氏抽提器内充入惰性气体，使加热回收溶剂和烘干样品同时进行。这样既可以使溶剂彻底回收，而且又使样品不会氧化损失。抽提结束即可称重，不必放入烘箱烘干半小时。这样使索氏抽提法（国际法）与其他三种方法在同一台仪器中进行对比校正。阳江职业技术学院生命科学与技术系索氏抽提法适用样品：谷物及其制品、干果、脱水蔬菜、茶叶、烟草土壤等阳江职业技术学院生命科学与技术系加砝码时遵循“由大到小，折半加入，逐级试验原则”，“指针总是偏向轻盘，投影标尺总是向重盘方向移动的原则”。阳江职业技术学院生命科学与技术系⑵.振荡浸提法：将样品粉碎后置于具塞三角瓶中，加入一定量的提取溶剂，用振荡器振荡提取1~3次，每次时间多在0.5~1h，有时也需要更长时间。过滤出溶剂后，再用溶剂洗涤滤渣一次或数次，合并提取液后进行浓缩净化。这一方法对于蔬菜、水果、谷物等样品都可以使用。阳江职业技术学院生命科学与技术系⑶.组织捣碎法：这也是一种常用的方法，效果较好。特别是对于一些新鲜动植物组织中农药的提取较方便，一般操作是将样品先进行适当的切碎，再放入组织捣碎机中，加入适当的提取溶剂，快速捣碎3～5min，过滤，残渣再重复提取一次即可。阳江职业技术学院生命科学与技术系⑷.消化提取法：用消化液把试样消煮分解后，再用溶剂提取的一种方法。适用于动物样品量少而又不易捣碎的器官（皮、鳃、肠等）。阳江职业技术学院生命科学与技术系（5）超声波提取超声波提取时将样品和溶剂放于密闭的容器中，置于具有一定能量的超声波水浴中，数秒后拿出，再放入、拿出。如此反复几次就可达到定量提取的目的。每次超声时间不能太长，避免溶剂过热沸腾，影响回收率。超声波提取法操作简单，一次可以同时提取多个样品。其提取时间短、速度快、提取效率高。超声波提取法主要应用在土壤中有机氯农药的提取。阳江职业技术学院生命科学与技术系3.3.2固相提取法固相提取法（SPE,solidphaseextraction），又叫液固提取法(liquid-solidextraction)，是指液体样品中的分析物通过吸着作用（吸附和吸收）被保留在吸着剂(sorbent)上，然后用一定的溶剂洗脱的过程。阳江职业技术学院生命科学与技术系慢中等快淋洗液阳江职业技术学院生命科学与技术系阳江职业技术学院生命科学与技术系固相提取技术最早由Breiter等(1976)提出，用于人体体液中的药物提取，称为“柱提取”，后用于水中农药的提取和净化，并称为“固相提取”。固相提取技术是取代“液液提取”的新技术，具有提取、浓缩、净化同步进行的作用，目前主要用于水样中分析物的提取，但也开始越来越多地应用于食品中农药残留分析的样品制备。阳江职业技术学院生命科学与技术系这一技术有重复性好、省溶剂、快速、适用性广、可自动化和用于现场等优点。在农药残留分析中，尤其是对较强极性农药（如氨基甲酸酯类农药）的提取能发挥很好的作用。阳江职业技术学院生命科学与技术系1.固相萃取的模式及原理固相提取的原理可以看作是一个简单的液相色谱过程，吸附剂为固定相，样品中的溶剂（水）或洗脱时的溶剂为流动相。它是利用吸附剂对农药和干扰性杂质吸着能力的差异所产生的选择性保留，对样品进行提取和净化。这种保留可通过改变吸附剂的类型、调整样品和洗脱溶剂的类型、pH值、离子强度和体积等来满足不同分析的需要。阳江职业技术学院生命科学与技术系商业化固相提取的吸附剂类型吸附剂类型分子作用应用十八碳烷基（C18）疏水反相萃取，非极性到中极性，有机磷，有机氯杀虫剂等辛烷基（C8）疏水反相萃取，非极性到中极性，有机磷，有机氯杀虫剂等环已烷基(CH)疏水反相萃取，非极性到中极性，有机磷，有机氯杀虫剂等中性氧化铝氢键极性，维生素、抗菌素、激素等阳江职业技术学院生命科学与技术系①阴离子交换②阳离子交换反相固相萃取正相固相萃取离子交换固相萃取阳江职业技术学院生命科学与技术系1)反相固相萃取流动相：极性（水溶液）或中等极性固定相：非极性。分离对象：中等到非极性物质。阳江职业技术学院生命科学与技术系原理分析物中的CH键+硅胶表面官能团→吸附→极性溶液中的有机分析物→保留在SPE。用非极性溶剂解吸吸附在固定相中的目标物质。阳江职业技术学院生命科学与技术系2）正相固相萃取流动相：非极性、中等极性固定相：极性。分析物质：极性、中等极性、非极性阳江职业技术学院生命科学与技术系原理保留取决于