第二章基因工程制药新版3

第三节基因工程制药生产的基本过程一、工具酶的分离纯化二、载体的分离纯化三、外源DNA和目的基因的分离和获得四、外源DNA与载体DNA的切割与连接五、宿主细胞的选择和基因导入操作六、基因工程菌的稳定性及生长代谢的特点七、基因工程菌中试八、基因工程菌的扩增和发酵生产九、基因工程药物的分离和纯化技术十、变性蛋白的复性十一、基因工程药物的质量控制十二、基因工程药物的制造实例三、外源DNA和目的基因的分离和获得（一）基本操作方法（二）不同类别DNA的提取技术（三）目的基因的制备（一）基本操作方法细胞内的DNA大多与RNA及蛋白质形成复合物，需要经过提取、分离、纯化，才能获得高纯度的DNA。1、操作条件2、提取方法3、分离方法4、纯化方法1、操作条件（1）含盐的中性缓冲液----以防在除去蛋白质的时候，使核酸产生不可逆转的变性。（2）低温条件----防止DNA在振荡、机械操作过程中的降解、断裂。（3）使用核酸酶抑制剂（柠檬酸、砷酸盐、EDTA）----以防止DNA被酶解。2、提取方法（1）机械法----破坏细胞，释放出DNA。（2）酶消化法---破坏细胞，释放出DNA。（3）用酶使蛋白质变性----除去蛋白质之后，就剩下DNA。（4）用酚、去垢剂使蛋白质变性----除去蛋白质，剩下DNA。3、分离方法是指从大分子的混合物中分离出DNA。具体方法有：（1）DEAE—纤维素柱层析法。（2）羟基磷灰石柱层析法。4、纯化方法分子筛层析法。凝胶电泳法。乙醇、三氯醋酸、聚乙二醇沉淀法。（二）不同类别DNA的提取技术1、质粒DNA的提取2、细菌染色体DNA的提取3、真核生物DNA的提取4、病毒DNA的提取1、质粒DNA的提取细菌培养↓质粒扩增↓菌落收集↓溶菌技术↓分离技术-------采用热或者碱使DNA变性，然后再进行冷却或者恢复到中性PH值，由于质粒DNA易于复性，而染色体DNA则不易复性、会沉淀下来↓提纯技术------采用溴乙锭密度梯度离心、二碘丙锭的氯化铯密度梯度离心，质粒DNA插入染料区带较多、而染色体DNA插入染料区带则较少。从而可以分离。2、细菌染色体DNA的提取采用冻融、溶菌酶、EDTA处理、去垢剂处理使得细胞裂解。↓裂解液用胰RNase和蛋白酶处理，使RNA和蛋白质降解。↓残留蛋白质用酚溶液、或者用（酚：氯仿=1：1）溶液进行抽取和离心，使提大部分蛋白质因为变性而沉淀于有机相与水相之间。↓含DNA的水相用乙醇沉淀，以获得丝状的DNA沉淀物，↓沉淀物用缓冲液透析，除掉去垢剂和有机溶剂。↓最后采用氯化铯（CsCl2）进行密度梯度离心法分离。3、真核生物DNA的提取（1）提取方法同2（2）注意事项对于纯度要求较高的DNA，必须采用氯化铯（CsCl2）密度梯度离心法进行分离。操作时要防止丢失线粒体DNA、和卫星DNA等密度异常成份。要防止低分子量的DNA的污染。4、病毒DNA的提取用少量λ噬菌体感染宿主，然后用大量的培养基进行感染细菌的培养，最后全部细菌都会被λ噬菌体感染。此法适应于制备大多数噬菌体。（三）目的基因的制备目的基因：准备要分离、改造、扩增或表达的基因。需要克隆的DNA片段编码某种蛋白质研究某基因结构和功能的关系研究某基因与疾病的关系1、物理分离法2、化学合成法3、逆转录法4、RT-PCR技术法5、筛选新基因的其它新方法1、物理分离法（1）分离方法（2）物理分离法实例（1）分离方法直接用酶切割、或者机械破碎分离法。DNA经过直接用酶切割、或者机械破碎之后，可产生编码不同基因的DNA片段，由于不同基因中的G-C碱基对含量、与A-T碱基对含量有差异，结果就导致它们之间的密度不同，因此通过分离技术+观察技术+鉴定技术结合，就能将其分离。分离技术----平衡等密度离心法、凝胶电泳法、溴乙锭染色法。观察技术----荧光显微镜观察。鉴定技术----核酸杂交法、瑟萨恩印迹转移技术。物理学密度梯度离心法不同DNA片段，其密度不同，借此进行密度梯度离心，实现分离。凝胶电泳分离技术通过凝胶电泳，分段收集大小不同的DNA片段，然后用快速转化法来检验其目的蛋白质，进行基因定位。实现分离。（2）物理分离法实例海胆组蛋白基因苏芸金杆菌晶体蛋白基因多角病毒的多角体蛋白基因β-半乳糖苷酶蛋白基因2、化学合成法（1）化学合成法的概念（2）化学合成法的优缺点（3）化学合成法的实例（1）化学合成法的概念和分类概念----以5’或3’-脱氧核苷酸、5’-磷酰基寡核苷酸片段为原料，用化学方法，将其逐个缩合成基因的方法，称为化学合成法。1976年H.G.Khorana提出了用化学方法合成基因的设想，并于1979年在science上发表了率先成功地合成大肠杆菌酪氨酸tRNA基因的论文。要求：1、已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列。2、分子量较小的目的基因的制备DNA多聚酶ⅠKlenow片段+dNTPs磷酸化退火分子克隆磷酸化退火DNA多聚酶ⅠKlenow片段限制性内切酶分子克隆基因的化学-酶促合成图解（2）化学合成法的优缺点化学合成法的优点----随意性强，可通过人工设计，进行合成、组装非天然基因，为实施蛋白质工程提供了强有力的手段，较小分子蛋白质或多肽编码的基因，15-30bp效果最好，1天完成。现在可达到一次合成寡核苷酸片段长达50-60bp化学合成法的缺点：（1）反应专一性不强、副反应多;（2）合成片段越长、分离纯化越困难、产率越低;（3）无法合成太长的基因，不能大于60bp;（4）人工合成基因时，遗传密码子的简并给选定密码子带来很大困难，人工合成时，遗传密码的简并性可导致中性突变;（5）合成费用较高。（3）化学合成法的实例讫今为止，通过化学合成方法已经了近百种产物的基因。主要有以下种类：细菌酪氨酸t-RNA人生长激素α干扰素γ干扰素血管紧张素人胰岛素人生长激素抑制释放因子溶菌酶组织血纤维蛋白溶酶原激活剂3、逆转录法（1）逆转录法的理由（2）逆转录法的理论依据（3）逆转录所产生的DNA的特性（4）逆转录法的具体步骤（5）逆转录法的实例（1）逆转录法的理由真核生物的基因不能直接分离，原因：（A）单一拷贝的基因只占到真核生物基因组的十万～千万分之一，数量十分微小，这就导致直接从真核生物染色体上制备目的基因的极为困难。（B）真核基因内一般都有内含子，会阻止基因的不正常表达。（C）将真核基因导入到原核细胞之中，由于原核细胞中缺乏mRNA转录后的加工系统，因此，从真核基因转录出的mRNA无法提到加工处理，也就不能成为成熟的mRNA。（2）逆转录法的理论依据逆转录法就是从mRNA→cDNA→DNA→mRNA→Protein的方法。（A）提取真核细胞的mRNA。（B）以mRNA为模板，在逆转录酶有作用下，反转录合成cDNA第一链。（C）再以cDNA为模板，在DNA聚合酶的作用下，合成DNA互补双链。（3）逆转录所产生的DNA的特性（A）只反映mRNA经过加工之后的基因编码序列，而不象真核生物的原始DNA那样具有复杂的信息承载。（B）不含内含子，可以在任何场合进行表达。（4）逆转录法的具体步骤A、mRNA的纯化B、cDNA第一链的合成C、cDNA第二链的合成D、cDNA的克隆和重组E、将重组体导入宿主细胞F、cDNA文库的鉴定G、目的cDNA克隆的分离和鉴定H、cDNA目的基因的阳性克隆的鉴定和验证技术A、mRNA的纯化mRNA的3’端常常含polyA，它能够吸附在寡聚脱氧胸腺苷酸OligodT-纤维素上，借此可以将mRNA与其它RNA进行分离。当RNA提取液流经寡聚脱氧胸腺苷酸OligodT-纤维素柱时，在高盐缓冲液的作用下，mRNA被特异性地吸附在柱上，其它RNA成份则被冲刷走掉，最后，用低盐溶液或者蒸馏水冲刷纤维素柱，mRNA就被洗脱下来。经过2-3次寡聚脱氧胸腺苷酸OligodT-纤维素柱之后，就可得到较高纯度的mRNA。mRNA的分离Oligo-dT纤维素柱Oligo-dT磁珠法B、cDNA第一链的合成由于mRNA的3’端常含polyA，所以可用寡聚脱氧胸腺苷酸OligodT做引物，在逆转录酶催化下，合成cDNA。为测算cDNA的合成效率，可在合成体系中加入放射性标记的dNTP，如α-32P-dATP、α-32P-dCTP，这样就可通过放射自显影技术，来计算dNTP的渗入量。C、cDNA第二链的合成先用碱水解的方法，或用RNaseH酶解的方法，除去cDNA-mRNA杂交链中的mRNA链。然后，再以cDNA第一链为模板，在DNA聚合酶的作用下，合成DNA互补双链。mRNAmRNA-cDNAHybridnick逆转录酶RNaseHDNA聚合酶T4连接酶T4DNA聚合酶处理形成平头末端NickTranslationcDNA的合成方法D、cDNA的克隆和重组（D1）、用于cDNA的克隆的载体（D2）、cDNA的片段与载体的连接（D1）、用于cDNA的克隆的载体当cDNA的插入片段小于10Kb时，应选用质粒载体。当cDNA的插入片段大于10Kb时，应选用噬菌体载体。表达型----是指重组后插入的cDNA能够经过转录、翻译，最终合成蛋白质。非表达型----是指重组后插入的cDNA不能经过转录、转译，合成蛋白质。质粒噬菌体表达型PUCλgt11非表达型pBR322λgt10（D2）、cDNA的片段与载体的连接（1）借助同型多聚体尾巴的连接方法----用3-末端脱氧核苷酸转移酶催化，在cDNA的3’末端加上polyG（或者polyT）的尾巴、而在载体的末端加上polyC（或者polyA）的尾巴，就能够实现cDNA的片段与载体DNA的连接。（2）加人工接头的连接法----所谓加人工接头的连接法，是指用采用T4DNA连接酶，在cDNA的末端加上人工接头，然后再使用特定的限制酶来切出粘性末端，从而实现与载体DNA的连接。E、将重组体导入宿主细胞λ噬菌体感染大肠杆菌形成噬菌斑。以便于使得质粒转化到大肠杆菌内。F、cDNA文库的鉴定表型鉴定法：（1）抗性基因失活法（2）菌落颜色（3）噬菌斑颜色改变分子鉴定法：（1）凝胶电泳（2）分子杂交（3）DNA序列测定G、目的cDNA克隆的分离和鉴定（1）核酸探针杂交法----根据目的蛋白质纯品的氨基酸序列分析结果，人工合成相应的单链寡核苷酸作为探针，从cDNA文库分离特异的cDNA克隆。（2）特异亲合鉴定法----对于那些表达水平低,不能纯化得到足量蛋白质的进行序列测定,利用一种能与靶蛋白特异结合的配体,从已构建的表达型重组文库中筛选该蛋白的基因。①已知的可在体内与靶蛋白相互作用的蛋白/小分子化合物②抗靶蛋白抗原决定簇的IgG③可被靶蛋白识别的小段DNA序列（5）逆转录法的实例通过逆转录法，已经合成了下列基因克隆株：（1）人生长激素（2）α-人干扰素（3）β-人干扰素（4）人尿激酶。4、RT-PCR技术法1985，PCR发明以后，RT-PCR得到了广泛的应用。特点：mRNA反转录合成cDNA第一链后，不用再合成cDNA第二链只是在特异性引物作用下，扩增近µg级的特异cDNA产物通过RT-PCR成功克隆的基因：IL-2,3,6,9、G-CSF、TNF、IFN-γ等是一种在体外利用酶促反应大量获得特异序列的基因组DNA或cDNA的专门技术，又称为无细胞的分子克隆。聚合酶链反应（PCR）模板DNA引物4种dNTPTaqDNA聚合酶含Mg2+的缓冲液。PCR的反应体系（1）变性，加热至95℃，使模板DNA解开成单链；（2）退火，温度降至适宜，使引物与模板互补结合；（3）延伸，温度升至72℃，DNA聚合酶以4种dNTP为底物，在引物的3’-OH上，合成与模板互补的DNA新链。PCR的基本反应步骤及原理PCR反应条件变性95˚C延伸72˚C退火Tm-5˚C5Primer15Primer2Cycle2Cycle1555555TemplateDNA55555555PCR基本工作原理Cycle3555555555555555525～30次循环后，模板DNA的含量可以扩大100万倍