第五章药物定量分析与分析方法的验证新

第五章药物定量分析与分析方法验证药物分析教研室Contents定量分析样品的前处理方法1定量分析方法的特点2药物分析方法的验证3第一节药品分析方法的验证一.目的：证明所采用的分析方法适合于相应的检测要求二.用途（一）药品质量标准起草时，分析方法需要经过验证。（二）药物合成方法变更、制剂组分变更、原分析方法进行修订时。三.需验证的分析项目1.鉴别试验2.杂质定量或限度检查3.原料或制剂中有效成分含量测定4.制剂中其他成分（降解产物、防腐剂）的测定5.溶出度、释放度等功能检查中的溶出量等的测试方法。四.验证内容精密度,准确度,检测限,专属性，定量限，线性、范围和耐用性（一）、准确度（accuracy）系指用该方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度。%100(%)%100(%)加入量本底量测得量回收率加入量测得量回收率回收率(Recovery)回收试验法加样回收试验3×3，至少9个测定结果回收试验：空白+已知量A的对照品（或标准品）测定，测定值为MR=M（平均）/A*100%加样回收试验：已准确测定药物含量P的真是样品+已知量A的对照品（或标准品）测定，测定值为M数据要求：规定的范围内，至少用9次测定结果评价，如制备三个不同浓度样品各测三次二、精密度(Precision)系指在规定的测试条件下，同一个均匀供试品，经多次取样测定所得结果之接近的程度。表示：偏差(d)、标准偏差(s)、相对标准偏差(RSD)重复性:同一实验室,同一人多次测定的精密度中间精密度:同一实验室，不同人，不同仪器测定的精密度重现性:不同实验室，不同人测定的精密度三、专属性(Specificity)指有其他成分（杂质、降解物、辅料等）可能存在情况下采用的方法能准确测定出被测物的特性。四、检测限(LimitofDetection,LOD)药物能被检出的最低浓度(µg/ml)1.非仪器分析目视法2.信噪比法一般以信噪比（S/N）3:1或2:1的相应浓度或注入量来确定检测限五、定量限(LimitofQuantitation,LOQ)药物能被定量测定的最低浓度(µg/ml)信噪比法S/N=10六、线性待测结果(响应值)与试样中被测物的浓度或量直接成正比关系的程度。Y=a+bx（r=0.9999)精密称取大黄素对照品约17.29mg,，置50mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为大黄素对照品储备液。精密吸取储备液0.2、0.5、1.0、3.0、5.0、7.0、9.0mL分别置10mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，按上述色谱条件，分别进样10μl，记录峰面积，以峰面积(y)为纵坐标、大黄素浓度(x)为横坐标进行线性回归，得回归方程。Y=2.962106X－4.958103r=0.9999结果表明大黄素溶液在6.92μg·mL-1~311μg·mL-1之间呈良好的线性关系。标准曲线与线性范围6.412.819.225.63232.41.81.20.60isHH茶碱(µg/ml)·····Y=9.56610-2X+6.15310-3r=0.9995至少6个浓度点建立标准曲线线性范围必须覆盖全部待测浓度，不得外推最低浓度点偏差在±20%其余浓度点的偏差在±15%。七.范围达到一定精密度、准确度和线性的条件下，测试方法适用的高低限浓度或量的区间。测定条件稍有变动时，对测定结果的影响程度影响因素：被测溶液的稳定性，流动相的组成和pH，商品柱的品牌，柱温等八、耐用性(Robustness)准确度精密度重复性中间精密度专属性检测限定量限线性/范围耐用性鉴别＋＋杂质定量＋－＋＋＋－＋＋＋杂质限度＋＋含量测定＋＋＋＋＋－－＋＋溶出量测定＋＋＋＋＋－－＋＋检验项目和验证内容①①已有重现性验证，不需验证中间精密度②如一种方法不够专属，可用其他分析方法予以补充②③视具体情况予以验证③各种含量测定方法对效能指标的要求1.容量分析法用原料药精制品(含量99.5%)或对照品考察方法的精密度，RSD≤0.2%；回收率一般在99.7～100.3%之间。2.UV法用适当浓度的精制品进行测定，其RSD≤1%。制剂的测定，回收率一般应在98～102％之间。3.HPLC法要求RSD2％，回收率98～102%之间。第二节定量分析样品的前处理方法不经有机破坏经有机破坏直接测定配位滴定法氧化还原滴定法水解后测定碱水解酸水解经还原分解后测定湿法破坏——凯氏定氮法干法破坏高温灼烧法氧瓶燃烧法一.含金属的有机药物分析(一)、结构分析富马酸亚铁邻二氮菲-硫酸铈滴定特点：药物中金属原子与药物连接的不牢固，在水溶液中可以离解成金属离子。1.金属原子不直接于碳原子相连或某些C-M键结合不牢固的有机金属药物。2.金属直接和碳原子相连的有机金属药物特点：药物中金属原子与药物连接的牢固，需要进行有机破坏。(二)、含量测定如富马酸亚铁含量测定1.含铁药物（溶解直接测定法）2.含锑药物（水解后测定法）如：葡萄糖酸锑钠二、经有机破坏的分析方法含氮、硫、硫柳汞、氯化钠的生物制品、含氮有机合成药物测定的前处理和生物制品中金属元素测定时生物基质的去除。H2SO4-HNO3H2SO4-HClO4H2SO4-H2SO4HNO3-KMnO4分解剂/消化剂辅助分解剂——凯氏定氮法测定含有氨基和酰胺结构的药物结构(一)湿法破坏原理将含氮药物与硫酸在凯氏烧瓶中共热，药物分子中有机结构被“消化”成CO2和H2O，有机结合的氮转化为无机氮，与过量的硫酸结合为硫酸氢铵和硫酸铵，经碱化后释放出氨气，随水蒸气馏出，用硼酸溶液或定量的酸滴定液吸收后，再用酸或碱滴定液滴定。常量法——含氮量25～30mg半微量法——含氮量1.0～2.0mg凯氏烧瓶K2SO4(提高消解温度)CuSO4(加快消解速度)硫酸碱液硼酸(吸收液)甲基红-溴甲酚绿指示剂硫酸滴定空白校正(二)干法破坏1.高温灼烧法常用于含卤素、含磷药物和药物中砷盐的检查。常加入无水碳酸钠、硝酸镁、氢氧化钙、氧化锌等辅助灰化。注意事项：（1）加热或灼烧时温度应控制在420摄氏度以下。（2）要灰化完全（3）经本法破坏后，所得灰分往往不易溶解，但不要轻易弃去。2.氧瓶燃烧法系指将含有待测元素的有机药物置于充满氧气的密闭的密闭的燃烧瓶中充分燃烧，使有机结构部分彻底分解为CO2和H2O，待测元素根据电负性的不同转化为不同价态的氧化物，被吸收于适当的吸收液中，再根据其性质和存在方式选择方法进行分析。第一节定量分析样品的前处理方法操作方法①样品的准备取样品适量，精密称定后按规定方法包裹，固定于铂丝下端的网或螺旋处。②燃烧瓶燃烧前的准备用洗液洗净后，按各药品项下的规定加入吸收液，将瓶口用水湿润，小心急速度地通入氧气1min,立即用表面皿覆盖瓶口。③样品的燃烧点燃包有供试品的滤纸尾部，迅速燃烧瓶中，按紧瓶塞，加水少量封闭瓶口，待燃烧完毕（应无黑色碎片），充分振摇，使生成的烟雾完全吸入吸收液中，放置15min，用水少量冲瓶塞及铂丝，合并洗液及吸收液，同法另做空白试验。然后按各药品项下规定的方法进行鉴别、检查或含量测定。有机药物含P吸收液测定方法茜素氟蓝分光光度法(pH4.3HAc-NaAcBuffer)H2O含F含Br银量法；分光法银量法；汞量法；分光法NaOH溶液含Cl磷钼蓝比色法银量法；碘量法；汞量法；分光法NaOH-硫酸肼饱和液含IH2O2－NaOH溶液NaOH-硫酸肼饱和液H2O④吸收液的选择⑤注意事项：（1）充氧气，使瓶内空气排尽（2）测定含氟有机药物时，用石英制燃烧瓶（3）铂丝燃烧时起催化作用（4）应同时做空白试验（5）燃烧时要注意防爆（6）燃烧要完全（7）燃烧产生的烟雾完全被吸收2.在药物含量测定中的应用碘苯酯的含量测定取本品约20mg，精密称定，照氧瓶燃烧法进行有机破坏，用NaOHT.S.2ml与H2O10ml为吸收液，待吸收完全后，加溴醋酸溶液10ml，密塞，振摇放置数分钟，加甲酸约1ml，用水洗涤瓶口，并通入空气流约3~5min，以除去剩余的溴蒸气，加KI2g，密塞，摇匀，用Na2S2O3液(0.02mol/L)滴定，至近终点时，加淀粉指示液，继续滴定至蓝色消失，并将滴定的结果用空白试验校正。每1ml的硫代钠液(0.02mol/L)相当于1.388mg的C19H29IO2。第三节定量分析方法的特点一.容量分析法将已知浓度的滴定液（标准物质溶液）由滴定管滴加到被测药物的溶液中，直至滴定液与被测药物反应完全，然后根据滴定液的浓度和被消耗的体积，按化学计量关系计算出被测药物的含量。适用范围：化学原料药的含量测定特点：方法简单仪器价格低廉、测定结果准确、方法耐用性高、方法专属性差二.光谱分析法1.紫外可见分光光度法朗伯比尔定律2.荧光分析法物质受紫外光或可见光照射激发后能发射出比激发光波长长的荧光。当激发光强度、波长、所用溶剂及温度等条件固定的时候，物质在一定浓度范围内，其荧光强度与溶液中该物质的浓度成正比关系，可用来进行定量分析。特点：（1）灵敏度高，10-12~10-10g/ml（2）荧光自熄灭（3）对于容易被光分解的样品，为了避免因激发光多次照射而影响荧光强度，我们可以选择一种激发光的波长与它近似的而对光稳定的物质配成适当浓度的溶液，作为基准溶液。（4）采用荧光衍生化试剂，使没有荧光或者荧光比较弱的物质和一种荧光试剂发生反应，得到一个强的荧光产物，来提高分析方法的选择性。三.色谱分析法1.HPLC法系统适用性试验：即用规定的对照品对色谱系统进行实验和条件①色谱柱的理论塔板数：在规定的色谱条件下，注入供试品溶液或各种项下规定的内标物质溶液，记录色谱图，量出供试品主成分或内标物质峰的保留时间TR和半峰宽Wh/2,按n=5.54(tr/wh/2)2计算色谱柱的理论板数。②分离度（R）无论定性鉴别或定量分析，均要求待测峰与其人峰、内标峰或特定的杂货对照峰之间有较好的分离度。除另有规定外，定量分析时分离度应大于1.5。③重复性取各品种项下的对照常溶液，连续进样5次，除另有规定外，其峰面积测量值的相对标准偏差应不大于2.0%。④拖尾因子（T）为保证分离效果和测量精度，应检查待测峰的拖尾因子是否符合各品种项下的规定。除另有规定外，峰高法定量时T应在0.95~1.05之间。峰面积法测定时，T值偏离过大，也会影响小峰的检测和定量的准确度。测定法：内标法加校正因子测定供试品中主成分含量外标法测定供试品中主成分的含量①外标法：用标准品的峰面积或峰高与其对应的浓度做一条标准曲线,测出样品的峰面积或峰高,在标准曲线上查出其对应的浓度,这是最常用的一种定量方法。含量Cx=CR×(AX/AR)②内标法：精密称取药物对照品和内标物质，分别配成溶液，精密量取各溶液适量，混合配成校正因子测定用的对照溶液。取一定量注入仪器记录色谱图。测量对照品和内标物质的峰面积。校正因子（f）=(AS/CS)/(AR/CR)AS为内标物质的峰面积；AR为对照品的峰面积；CS为内标物质的浓度；CR为对照品的浓度含量Cx=f×(AX/（Aˊs/cˊs)内标物质的峰面积和浓度内标法和外标法比较：1.内标法可避免因样品前处理和进样体积误差对结果的影响。2.外标法比较简单，但要求进样量准确且操作条件稳定。建议采用定量环满进样或自动进样器进样。四.含量测定计算1.原料药：实际百分含量上限：101.0%下限：98.5%、99.0%、99.5%2.制剂：标示百分含量95.0%---105.0%93.0%---107.0%90.0%---110.0%一.原料药含量测定方法（实际百分含量）W%=实际测得量/取样量*100%（一）.容量法%100WFTV(%)含量规定摩尔浓度实际摩尔浓度FW：取样量F：浓度校正因子T：滴定度T=C标*（b/a）*M测（每1ml标准溶液相当于待测物质的质量）滴定度：每1ml标准溶液相当于待测物质的质量T=C标*（a/b）*M测C标：滴定液的摩尔浓度（mol/l）a:被测药物的摩尔数b:滴定剂的摩尔数M：被测药物的摩尔质量（mg）1.碘量法测VC含量的时候，若VC的分子量为176.13，每1ml