第十三章生化药物制造工艺多肽与蛋白质类药物

第二节多肽与蛋白质类药物一、多肽与蛋白质类药物概述多肽和蛋白质是生物体广泛存在的重要生化物质。具有多种多样的生理生化功能，也是一类重要的生物药物。（一）多肽类药物活性多肽是生化药物中非常活跃的一个领域。动物体内已知的活性多肽主要是从内分泌腺、组织器官、分泌细胞和体液中产生获得的。从植物中发现和研究新的活性多肽也引起了人们广泛的注意。许多活性蛋白质、多肽都是由无活性的蛋白质前体，经过酶的加工剪切转化而来的。从寻找新药的角度看，研究活性多肽结构与功能的关系，有助于了解多肽中哪些氨基酸序列是活性所必需的，以便以更短的多肽来代替。用不同的氨基酸去置换活性多肽中的有关氨基酸，可以提高其生理活性，减少临床的不良反应。同时，对氨基酸排列形式——立体结构的研究，有助于设计新的活性多肽类药物。目前，主要的多肽类药物有以下几种：1、多肽激素（1）垂体多肽激素（2）下丘脑激素（3）甲状腺激素（4）胰岛激素（5）胃肠道激素（6）胸腺激素2、多肽类细胞生长调节因子表皮生长因子（EGF）、转移因子（TF）、心钠素（ANP）等。3、含有多肽成分的其他生化药物（二）蛋白类药物蛋白质生化药物除了蛋白质类激素和细胞生长调节因子外，还有像血浆蛋白质类、黏蛋白、胶原蛋白及蛋白酶抑制剂等大量的其他生化药物品种。作用方式也从生化药物对机体各系统和细胞生长的调节扩展到被动免疫、替代疗法、抗凝血剂以及蛋白酶的抑制剂等多种领域。自20世纪70年代后期开始，人们首先把目标集中在应用基因工程技术制造重要的蛋白质药物上。现正从微生物和动物细胞的表达向转基因动植物发展。鉴于一些蛋白质和多肽生化药物有一定的抗原性、容易失活、在体内的半衰期短、用药途径受限等难以克服的缺点。对一些蛋白质类生化药物进行结构修饰、应用计算机图像技术研究蛋白质与受体及药物的相互作用、发展蛋白质工程及设计相对简单的小分子来代替某些大分子蛋白质类药物并且起到增强或增加选择性疗效的作用等。主要蛋白质类药物有以下几种：1、蛋白质激素（1）垂体蛋白质激素。（2）促性腺激素。（3）胰岛素及其他蛋白质激素胰岛素、胰抗脂肝素、松弛素、尿抑胃素。2、血浆蛋白质3、蛋白质类细胞生长调节因子4、黏蛋白5、胶原蛋白6、碱性蛋白质硫酸鱼精蛋白等。7、蛋白酶抑制剂胰蛋白酶抑制剂、大豆胰蛋白酶抑制剂等。8、植物凝集素二、多肽与蛋白质类药物的制造方法目前用于多肽和蛋白质类药物的制造方法主要有三种：提取分离纯化法、化学合成法和基因工程法。这里重点介绍提取分离纯化法。（一）蛋白质与多肽类药物提取、分离纯化1、材料选择采用提取分离纯化法获得的多肽及蛋白质类药物，其原料的主要来源有动植物组织和微生物等，原则是要选择富含所需蛋白质多肽成分的、易于获得和易于提取的无害生物材料。对天然蛋白质类药物，为提高质量、产量和降低生产成本，对原料的种属、发育阶段、生物状态、来源、解剖部位、生物技术产品的宿主菌或细胞都有一定的要求，了解这些，可使分离纯化工作事半功倍。（1）种属牛胰含胰岛素单位比猪胰高。抗原性则猪胰岛素比牛胰岛素低，前者与人胰岛素相比，只有1个氨基酸的差异，而牛有3个氨基酸的差异。由于种属特异性的关系，用猪垂体制造的生长素对人体无效，不能用于人体。由动物细胞产生的干扰素与人干扰素抗原有交叉反应，而对一些非同源性动物的某些细胞抗病毒活性作用并不下降。（2）发育生长阶段幼年动物的胸腺比较发达，老龄后逐渐萎缩，因此胸腺原料必须采用幼龄动物。HCG在妊娠妇女60～70d的尿中达到高峰，到妊娠18周已降到最低水平。然而HMG必须从绝经期的妇女尿中获取。肝细胞生长因子是从肝细胞分化最旺盛阶段的胎猪或胎牛肝中获得的，若用成年动物，必须经过肝脏部分切除手术后，才能获得富含肝细胞生长因子的原料。（3）生物状态动物饱食后宰杀，胰脏中的胰岛素含量增加，对提取胰岛素有利，但胆囊收缩素的分泌使胆汁排空，对胆汁的收集不利。（4）原料来源血管舒缓素可分别从猪胰脏和猪颚下腺中提取，两者生物学功能并无二致，而稳定性以颚下腺来源为好，因其不含蛋白水解酶。（5）原料解剖学部位猪胰脏中，胰尾部分含激素较多，而胰头部分含消化酶较多，如分别摘取则可提高各产品的收率：胃膜素以采取全胃黏膜为好，胃蛋白酶则以采取胃底部黏膜为好，因胃底部黏膜富含消化腺。2、提取提取的总要求是最大限度地把有效成分提取出来，关键是溶剂的选择。提取所用溶剂的选择标准，首先对被制备物具有最大溶解度，并在提取中尽可能减少一些不必要的成分。为了更好地达到以上两个目的，常用的手段是调整溶剂的pH、离子强度、溶剂成分配比和温度范围等。3、分离纯化多肽及蛋白质的分离纯化是将提取液中的目的蛋白质与其他非蛋白质杂质及各种不同蛋白质分离开来的过程，常用的分离纯化方法有：（1）根据蛋白质等电点的不同来纯化蛋白质蛋白质、多肽及氨基酸都是两性电解质。其净电荷为零，此时环境的pH即为该蛋白质的等电点。在等电点时蛋白质性质比较稳定，其物理性质如导电性、溶解度、黏度、渗透压等皆最小，因此可利用蛋白质等电点时溶解度最小的特性来制备或沉淀蛋白质。两性物质的等电点会因条件不同（如在不同离子强度的不同缓冲溶液中，或含有一定有机溶媒的溶液中）而改变。蛋白质在介质中的等电点是和介质中其他成分的存在有关系的。用等电点法沉淀蛋白质常需配合盐析操作，而除去不需要的杂蛋白时，常需配合热变性操作。等电聚焦电泳除了用于分离蛋白质外，也可用于测定蛋白质的等电点。（2）根据蛋白质分子形状和大小的不同来纯化蛋白质蛋白质的一个主要特点是分子大，而且不同种类的蛋白质分子大小也不相同。由此可以用凝胶过滤法、超滤法、离心法及透析法等将蛋白质与其他小分子物质分离，也可将大小不同的蛋白质分离。用超滤法时，超滤膜截留分子量常与实际情况不一致。分子量相近的蛋白质由于在介质中有呈线性溶质或者是球形溶质的区别，可能出现不同的结果。葡聚糖凝胶含有少量的酸性基团，故有较弱的离子交换作用，此外还有吸附作用。可采用低浓度的盐溶液，或者用与待分离蛋白质相同的标准蛋白质预先使凝胶柱平衡，以期不损失所分离的蛋白质。（3）根据蛋白质溶解度的不同来纯化蛋白质蛋白质的溶解度受溶液的pH、离子强度、溶剂的电解质性质及温度等多种因素的影响。适当改变外界条件，可以有选择地控制某一种蛋白质的溶解度，达到分离的目的。属于这一类的分离方法有蛋白质的盐溶与盐析法、结晶法和低温有机溶剂沉淀法。乙醇和丙酮是有机溶剂沉淀法中最常用的有机溶剂，由于丙酮的介电常数小于乙醇，故丙酮沉淀能力比乙醇强。根据实践，乙醇沉淀的物质，改用丙酮可减少l0％左右。（4）根据蛋白质电离性质的不同来纯化蛋白质离子交换剂作为一种固定相，本身具有正离子或负离子基团。它对溶液中不同的带电物质呈现不同的亲和力，从而使这些物质分离提纯。对蛋白质的离子交换层析，一般多用离子交换纤维素或以葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等为骨架的离子交换剂。主要是取其有较大的蛋白质吸附容量、较高的流速和分辨率等优点。可按不同情况选择离子交换条件：如果吸附得太牢，可改用交换当量较小的交换剂，或改变条件降低交换剂上带电基团的解离度。（5）根据蛋白质功能专一性的不同来纯化蛋白质主要的手段是亲和层析法，即利用蛋白质分子能与其相应的配体进行特异的、非共阶键的可逆性结合而达到纯化的目的。用亲和层析纯化某种蛋白质，有时并不能取得预期的效果。原因之一就是非专一性吸附问题，非专一地吸附一些无关的蛋白质而与专一吸附的蛋白质相混杂，影响了分离效果。非专一性吸附主要来自吸附剂上的离子基团和疏水基团。固相化金属亲和层析（IMAC）蛋白质分子中的咪唑基和巯基可与一些金属元素形成配位结合。（6）根据蛋白质疏水基团与相应的载体基团结合来纯化蛋白质蛋白质分子上有疏水区，这些疏水区，能够与吸附剂上的疏水基团结合，再通过降低介质的离子强度和极性，或用含有去垢剂的溶剂，提高洗脱剂的pH等方法将蛋白质洗脱下来。（7）根据蛋白质在溶剂系统中分配的不同来纯化蛋白质这是一种以化合物在两个不相溶的液相之间进行分配为基础的分离过程，称之为逆流分溶，利用逆流分溶技术分离垂体激素、氨基酸、DNA是很有效的。（8）根据蛋白质的选择性吸附性质来纯化蛋白质在蛋白质分离中，最广泛使用的吸附剂有结晶磷酸钙（羟灰石）、磷酸钙凝胶、硅胶、皂土沸石、硅藻土、活性白土、氧化铝以及活性炭等。（9）根据蛋白质的某些特殊性质进行纯化如：白蛋白在弱酸性条件下加辛酸钠可耐受67℃的温度，而其他蛋白质将变性。球蛋白或白蛋白在碱性条件下，可以和利凡诺作用，形成络合物而与其他蛋白质分离。细胞色素C和胰岛素可用一定浓度的蛋白沉淀剂如三氯醋酸沉淀，而保存其活力。又如：酶蛋白——超氧化物岐化酶（SOD）能抵抗蛋白水解酶的水解，因而可用蛋白水解酶降解其他蛋白质，以便于SOD进一步的纯化。4、分离纯化方法的选择分离纯化是整个生化制备过程的核心部分。对于某一物质，究竟选用什么分离纯化方法最理想，主要是根据该物质的物理化学性质和具体实验条件而定。认真参考借鉴前人经验可以避免许多盲目性，节省实验摸索时间。即使是分离一个新的未知组分，通过分析预试验的初步结果，参考别人对类似物质分离纯化经验，也可以帮助少走些弯路。5、溶液中蛋白质浓度的测定在蛋白质分离纯化过程中，蛋白质浓度的测定是不可缺少的手段。溶液中蛋白质的浓度可根据它们的物理、化学性质，如折射率、相对密度、紫外光吸收来测定；可用化学反应方法，方法中，紫外吸收法、双缩脲法、福林－酚试剂法、考马斯亮蓝染色法最为常见，它们操作简单，不需要昂贵的设备。以下主要介绍这几种方法。（1）紫外吸收法①280nm光吸收法。在280nm处测定光吸收值。通常以浓度是1mg蛋白质／ml溶液的A280为1.0进行估算。若已知该蛋白质的文献值，可直接计算出样品溶液中蛋白质的浓度。②280nm和260nm的吸收差法。若样品中含有嘌呤、嘧啶等吸收紫外光的核酸类物质，在用A280来测定蛋白质浓度时，会有较大的干扰。由于核酸在260nm的光吸收比280nm更强，因此可利用280nm及260nm的吸收差来计算蛋白质的浓度。③2l5nm和225nm的吸收差法蛋白质的肽键在200～250nm有强的紫外光吸收，用215nm和225nm光吸收差值。减少非蛋白质成分引起的误差。（2）双缩脲法①常量双缩脲法。蛋白质含有多个肽键、因此有双缩脲反应。在碱性溶液中蛋白质与铜离子形成紫红色化合物、可在540nm处比色测定。②微量双缩脲法。由于铜与蛋白质复合物的最大吸收峰在260～280nm。在310～330nm测定干扰因素少一些，因此。选用310nm进行比色测定。（3）福林－酚试剂法本方法首先在碱性溶液中形成铜与蛋白质复合物，然后该复合物中的酪氨酸和色氨酸残基还原磷钼酸－磷钨酸试剂（福林试剂），产生深蓝色。本法可用750nm比色测定，或500nm比色测定，本法的标准曲线线性较差，样品浓度需按标准曲线校正。（4）考马斯亮蓝G－250染色法考马斯亮蓝G－250在酸性溶液中为棕红色，当它与蛋白质通过疏水作用结合后，变为蓝色，可在595nm比色测定。但不同蛋白质之间的差异较大，且标准曲线线性较差。6、纯度检查蛋白质的纯度是化学和物理学的概念，蛋白质的聚合状态、辅基的存在、蛋白质的变性作用等极大地影响其生物活性，而这些因素的影响往往是用一般纯度检查的方法所查不出来的，这是值得注意的一种情况。常用蛋白质纯度检查的方法有：（1）HPLC－或FPLC这是蛋白质纯度检查常用的有效方法。美国药典已规定把HPLC用于胰岛素纯度的检测项目中。（2）电泳法凝胶电泳呈现单一区带，是纯度的一个重要指标，说明样品的荷质比（电荷／质量）是均一的。如果在不同的pH下进行凝胶电泳都是一条区带，则结果更加可靠。（3）免疫化学法主要有免疫扩散、免疫电泳、双向免疫电泳扩散、放射免疫分析、酶标免疫分析等。此法适用于能产生特异性抗体的蛋白质，无论是检查所需要的或者是被污染的蛋白质都适用。（4）生物测定法利用动物体或动物的离体器官、细胞进行生物效价的测定，这种方法接近动物临床所产生的生物学效应，因此实际意义也更大。（5）分光光度法