第十章甾体激素类药物的分析

第十章甾体激素类药物的分析Analysisofsteroidhormones激素（Hormone，荷尔蒙）是人体内各种内分泌腺所分泌的一种生物活性物质。激素作用于特定的称为靶器官的组织、细胞上而发挥作用。如果激素分泌出现平衡失调，可使人体发生病变，如甲亢、糖尿病等。C20C21ABCD12345678910111213141516171819基本结构概述甾体激素类药物均具有环戊烷骈多氢菲母核。分类甾体激素肾上腺皮质激素性激素雄性激素孕激素雌激素蛋白同化激素OHOOHOCH2OHHHH（一）肾上腺皮质激素△4–3–酮基（紫外吸收）天然皮质激素：氢化可的松母核有21个碳原子C17–醇酮基（还原性）OHOOHOHFHOCH3OHCH3醋酸地塞米松结构修饰OHOHOHCH3HHHOHFCH3O曲安息龙OHOHCH3HHHHOFCH3OOPONaOONaOH地塞米松磷酸钠提高结构稳定性增强抗炎作用（二）雄性激素和蛋白同化激素OHO天然雄性激素：睾酮△4–3–酮基4位引入卤素或19位去甲基或将A环结构改造均明显降低雄性作用，增加蛋白同化作用母核有19个碳原子A环中有△4–3–酮基结构结构修饰OOCCH2CH3OOOHCH3增加脂溶性，制成油注射剂可口服、延效丙酸睾酮甲睾酮增加位阻，难代谢氧化，稳定性增强可口服蛋白同化激素苯丙酸诺龙OOOCCH3Cl4-氯醋酸睾丸素OOHHHHO母核有18或19个碳原子（三）孕激素OCH3HHHCH3OHCH3C17-α-甲酮基△4–3–酮基天然孕激素：黄体酮母核有21个碳原子口服被迅速破坏失效，只能肌注结构修饰OCH3HHCH3OOHCH3OCH3CH3OHOHHHH3CHCCH醋酸甲地孕酮（孕酮类孕激素）炔诺孕酮（睾酮类孕激素）OHOHHHCH3HCCH炔诺酮（睾酮类孕激素）口服、长效口服、长效，17-OH作成庚酸酯，注射一次可维持3个月（四）雌激素天然的雌性激素：雌二醇母核有18个碳原子A环为苯环，C3位上有酚羟基，C17位上有β-羟基结构不稳定，口服无效OHCH3HHHHHOOHOHOHOCOCH2CH2CH2CH3OHOHCCH结构修饰COOOH炔雌醇戊酸雌二醇苯甲酸雌二醇乙炔基引入，使仲醇变叔醇，增加空间位阻，阻碍酶对药物的氧化代谢，可口服17位羟基酯化，酯在体内缓慢水解，延效3位羟基酯化，酯在体内缓慢水解，延效可口服高效长效人工合成代用品：非甾体化合物OHOH己烯雌二酚高效、长效△4–3–酮C17–α–醇酮基C17–β–羟基C17–甲酮基A环为3–OH苯环肾上腺皮质激素++雄性与蛋白同化激素++雌性激素++孕激素++鉴别反应UV、羰基试剂、氨基脲反应还原性（碱性酒石酸酮、氨制AgNO3）可成酯与亚硝基铁氰化钠、间二硝基苯反应UV、与重氮苯磺酸盐反应二、特殊官能团与分析方法第二节鉴别试验一、物理常数的测定二、化学鉴别法三、制备衍生物测定熔点四、紫外分光光度法五、红外分光光度六、薄层色谱法七、高效液相色谱法第二节鉴别试验二、化学鉴别法（一）呈色反应（1）与强酸的呈色反应强酸：H2SO4、H3PO4、HClO4、HCl原理：酮基先质子化，形成正碳离子，再与HSO4-作用呈色。显色荧光加水稀释氢化可的松棕黄色至红色绿色黄色至橙黄色炔雌醇橙红黄绿玫红絮状↓炔雌醚橙红黄绿红色↓泼尼松黄→橙—黄色渐变蓝绿色泼尼松龙深红—灰色絮状↓地塞米松淡红棕色—颜色消失苯甲酸雌二醇黄绿色蓝色淡橙色与硫酸显色反应1、C3–酮基和C20–酮基（1）与羰基试剂2,4-二硝基苯肼、异烟肼、硫酸苯肼反应生成腙。(2)官能团的呈色反应CONHNH2NO2NO2NCONHNH2CONHNH2.H2SO4（2）与羟胺或氨基脲分别生成具有一定熔点的肟或缩氨脲。NCONHNH2OCH3HHHCH3OHCH3NONHON+NNNHCONHONNHCl黄色3，20-双腙室温下长时间加热结论：成腙反应中C20–酮基受C18甲基的空间位阻影响，反应较慢，需加热或较长时间放置，才完成反应。C11–酮基受C18、C19位甲基甲基的阻碍，不发生反应。C3–酮基空间位阻最小，最易起反应，室温下先生成单腙。OCH3HHHCH3OHCH32、C17–α–醇酮基的呈色反应（还原性）能与碱性酒石酸铜试液（斐林试液）、氨制AgNO3试液（多伦试液）、四氮唑盐反应呈色。其中以四氮唑盐的显色反应最为常用，不但可用作层析法的显色剂，还可用于含量测定.适用：肾上腺皮质激素。OC=OHOCH2OHOHOC=OHOOHCHOHOHOC=OCH2OCOCH3＋2Cu2++4OH-+Cu2O+H2O橙红色＋2Ag++2OH-OC=OHOOHCHOHOH+2Ag+CH3COOH黑色醋酸去氧皮质酮OC=OOHOCH2OCOCH3NNNNOC=OOHCHOHOHO+H2ONNNN+CH3COOH++OH-醋酸泼尼松深红色的三苯甲鐕四氮唑盐结论：三苯甲鐕于490nm处显示最大吸收，可用比色法测含量。四氮唑盐反应还用于肾上腺皮质激素类药物中杂质“有关物质”检查的显色剂。反应在碱性条件下（水解）进行。适用：具有甲酮基或活泼亚甲基的甾体激素类药物。3.甲酮基的呈色反应能与亚硝基铁氰化钠、间二硝基酚、芳香醛反应呈色。孕激素（1）甲酮基：☻黄体酮专属性反应。黄体酮其他甾体亚硝基铁氰化钠蓝紫色淡橙色或不显色结论：在碱性条件下进行。与亚硝基铁氰化钠反应称为碱性硝普钠反应。（2）亚甲基的反应：硫酸普拉睾酮乙醇间二硝基苯氢氧化钠紫红色适用：雌激素类药物。4.酚羟基的呈色反应能与重氮苯磺酸发生偶合反应，生成红色偶氮染料。OHCOOSO3-N=NOHCOOSO3HN=N苯甲酸雌二醇H++红色有机氟Fˉ有机破坏有机氯5、卤元素的呈色反应茜素氟蓝—硝酸亚铈硝酸—硝酸银呈蓝紫色ClˉAgCl氯原子结合在母核环上6、沉淀反应（1）与碱性酒石酸铜（斐林试液）的沉淀反应（2）氨制AgNO3（多伦试液）的沉淀反应（3）与AgNO3的沉淀反应适用：含炔基的甾体激素类药物（炔雌醇、炔诺酮）。机理：RCCHAgNO3RCCAg↓HNO3++NaOH滴定，电位法指示终点（4）与HNO3-AgNO3的沉淀反应适用：甾体激素类药物C21位上有氯原子取代，如丙酸氯倍他索。机理：有机氯原子水解加热无机氯原子结合在母核环上的氯原子氧瓶燃烧法破坏无机氯原子硝酸—硝酸银AgCl原理：一些甾体激素类药物具有醋酸酯、戊酸酯及已酸酯的结构，可先行水解，根据水解产物来鉴别。7、水解产物的反应适用：本类药物C3、C17或C21位上羟基的酯结果：醋酸酯水解后生成的醋酸可与乙醇反应，生成有香气醋酸乙酯。戊酸或己酸酯类水解后可生成有特臭的戊酸或己酸，进行鉴别。三、制备衍生物测熔点（二）酯的水解醇制KOH水解m.p.为150℃~156℃（一）酯的生成OHOHCCHCOOOH+KOH丙酸睾丸素睾丸素m.p.为201℃COCl+m.p.约182℃（分解）（三）缩氨基脲的生成OOHHHHOOHOHHHCH3HCCHH2NCONHNOOCCH2CH2苯丙酸诺龙苯丙酸诺龙缩氨脲H2NCONHNH2（四）酮肟的生成炔诺酮HONH2炔诺酮肟m.p.约195℃（分解）CCHHONOH醋酸泼尼松△４-3-酮（五）UV-ViS分光光度法240nm左右280nm左右苯环其他共轭结构原理200-760nm有特征吸收。方法可规定最大吸收波长、A、吸收系数、A大/A小。示例曲安息龙丙酸倍氯米松溶剂甲醇乙醇浓度20μg/ml20μg/ml结果判断在238nm处有最大吸收在239nm处有最大吸收，A为0.57～0.60，在239nm与263nm处的吸收度比值为2.25～2.45结构特征：酚羟基C17–OHC17–乙炔基eg1:炔雌醇OHCCHHO（六）IR法原料药1505cm-13505cm-13300cm-1νCHvCCν1590cm-13610cm-1酚羟基醇羟基1615cm-1苯环的骨架振动eg2：黄体酮COHHHCH3O△４-3-酮结构特征：C17-酮基1700cm-1C=O20位酮基1665cm-13位酮基1615cm-1870cm-1C-H双键七、TLC法八、HPLC应用甾体激素类药物原料与制剂的鉴别甾体激素类药物原料与制剂的鉴别（如：醋酸曲安奈德软膏、醋酸氟轻松软膏）方法对照品法对照品法结果判断要求供试品溶液所显主斑点的颜色和位置与对照品溶液的主斑点相同要求在含量测定项下记录的色谱图中，供试品峰的tR与对照品峰的tR一致第三节特殊杂质检查杂质来源：原料、中间体、异构体、降解产物以及试剂和溶剂。一、有关物质的检查其他甾体：有些杂质与该甾体激素药物结构类似，也具有一定的药理作用而又互不相同，因此在甾体激素类药物的质量控制中，“其他甾体”的限度检查显得很重要。检查方法：（具有一定分离能力）判定方法：规定杂质斑点数目规定杂质斑点颜色1、TLC法（自身对照法）eg：氢化可的松中其他甾体的检查供试液：本品+氯仿-甲醇（9：1）浓度：3.0mg/ml对照液：供试液（3.0mg/ml）+氯仿-甲醇（9：1）60μg/ml层析：供试液对照液点样、展开、斑点检出。判断：供试液如显杂质斑点，不得多于3个，其颜色与对照液的主斑点比较，不得更深。2、HPLC法（自身对照法）≤图A中峰1面积的四分之三判定方法：规定杂质峰数目规定杂质峰面积二、游离磷酸盐的检查方法：对照品比色法杂质来源：地塞米松磷酸钠生产过程中，由磷酸酯化时残存的过量磷酸盐。结果判断：供试品溶液的吸光度不得大于对照溶液的吸光度。740nm原理：供试液+钼酸铵+1-氨基-2-萘酚-4-磺酸钼蓝三、有机溶剂残留量的检查eg：地塞米松磷酸钠方法：GC色谱法杂质来源：地塞米松磷酸钠生产中，使用大量甲醇和丙酮。结果判断：不得出现甲醇峰，甲醇含量≤0.3％丙酮规定不得过≤5.0%四、硒的检查氧瓶燃烧二氨基萘比色法测定杂质来源：地塞米松、氟轻松和曲安奈得等甾体激素类药物，在生产中使用二氧化硒(SeO2)脱氢工艺，药物可能引入杂质硒。方法：药物结果判断：供试品溶液的吸光度不得大于硒对照溶液的吸光度（0.005％～0.01％）。378nm五、雌酮六、乙炔基第四节含量测定常用方法容量法比色法紫外分光光度法荧光法气相色谱法高效液相色谱四氮唑盐比色法异烟肼比色法铁-酚试剂比色法一、HPLC法USP、BP、JP均采用方法：RP－HPLC（内标法）测定对象：甾体激素类药物的原料和制剂。eg：黄体酮的含量测定色谱条件：固定相ODS，检测波长254nm流动相甲醇-水（65:35）内标物己烯雌酚系统适用性试验：n1000，R符合规定。测定样品：黄体酮原料、注射液。定量方法：内标法内标-1二、UV-ViS分光光度法1、△４-3-酮240nm（±）2、苯环280nm（±）雌激素肾上腺皮质激素雄性激素和蛋白同化激素孕激素（一）UV分光光度法缺点：专属性不强示例：醋酸地塞米松片的含量均匀度检查（1）配制供试液，取10片分别进行测定（2）测定：240nm（3）计算（二）比色法有色甲瓒四氮唑盐醇酮基-a-17COH-1、四氮唑盐比色法（1）原理：肾上腺皮质激素类C17-α－醇酮基强还原性。CNNNN+Cl-CNNNNHe2[H]氯化三苯四氮唑（TTC）三苯甲瓒↓深红nm490~480maxCl-+CNNNNOCH3+-ClCNNNNOCH3蓝四氮唑（BT）525nm25℃氢氧化四甲基铵对照液供试液ATTC40～45′暗（2）方法：对照品法（3）影响因素A.基团对反应速度的影响C11=O＞C11－OHC21－OH未酯化＞C21-OH酯化B、溶剂和水分的影响以无水乙醇为溶剂，水含量大时，呈色减慢，不超过5％对结果没有影响。C、O2与光线的影响避光、隔绝空气、快速、充N2D、碱的种类及加入顺序以氢氧化四甲基铵的结果最佳加入顺序：皮质激素溶液四氮唑盐碱试液E.温度与时间室温（25℃）反应40～45minF.干扰物的影响油膏、冷霜等制剂含聚乙二醇、丙二醇、羊毛脂对BT的