糖尿病动物模型及中药治疗概况

1糖尿病动物模型及中药治疗概况第一部分糖尿病的动物模型在介绍糖尿病的动物模型之前，首先简要说明一下糖尿病的分型[1]。糖尿病是一类由遗传、环境、免疫等因素引起的、具有明显异质性的慢性高血糖症及其并发症所组成的综合征，并非单一病因所引起的单一疾病。糖尿病分为：Ⅰ型糖尿病、Ⅱ型糖尿病和其它特异性糖尿病。Ⅰ型糖尿病即胰岛β细胞破坏，常导致胰岛素绝对性缺乏，以往称为胰岛素依赖型糖尿病、青年发病型糖尿病，本型病因及发病是由于胰岛β细胞受到细胞介导性自身免疫性破坏。Ⅱ型糖尿病由于胰岛素抵抗并胰岛素分泌不足所致，以往称为非胰岛素依赖型糖尿病、成年发病型糖尿病，常伴有明显的遗传因素，但遗传机制尚未阐明。其它特异性糖尿病包括，β细胞功能的基因缺陷、胰岛素作用的基因缺陷、胰腺外分泌疾病、内分泌疾病、药物或化敏学制剂所致的糖尿病、感染、非常见型免疫介导性糖尿病以及有时并发糖尿病的其它遗传综合症。下面我将按照糖尿病的分型，介绍相应的糖尿病动物模型。一、Ⅰ型糖尿病动物模型的建立（一）手术方法（胰腺切除法[2]）是最早的糖尿病动物模型复制方法。1890年,Mehring和Minkowski报道，在切除狗胰腺后，出现多尿、多饮、多食和严重的糖尿现象。一般选用较大的实验动物，如狗和家兔等，其次用大鼠。全部切除胰腺，可制成无胰性糖尿病动物模型，需补充外源性胰酶。全部切除胰腺，除可引起高血糖外，并可致酮症酸中毒和死亡，故一般主张切除75%～90%的胰。（二）化学药物特异性破坏胰岛β细胞1、四氧嘧啶（alloxan）四氧嘧啶产生超氧自由基而破坏β细胞，导致胰岛素合成减少，胰岛素缺乏。其作用可能与干扰锌的代谢有关。豚鼠具有抗药性。四氧嘧啶引起的血糖反应分三个时相，开始血糖升高，持续约2h，继而因β细胞残存的胰岛素释放引起低血糖约6ｈ，12ｈ后开始持久的高血糖。（1）小鼠给药剂量因给药途径不同而异（均需临用前配）200mg/kg（ip），85-100mg/kg（iv）。四氧嘧啶制备小鼠糖尿病模型的影响因素很多。王柳萍等[3]观察四氧嘧啶剂量、给药途径、给药次数及小鼠体重对糖尿病小鼠血糖、死亡率、转阴率的影响。结果发现，随剂量的增加，小鼠死亡率增高；小鼠体重增加，死亡率亦增高；静脉注射成模率比腹腔注射高；同等剂量分次给药,死亡率、转阴率均降低，认为四氧嘧啶以同等剂量分次给药小鼠糖尿病成模率高。黄敏等[4]通过ｉｐ四氧嘧啶（ＡＬＸ）建立速发型糖尿病小鼠模型观察不同禁食时间对ＡＬＸ糖尿病小鼠模型的血清胰岛素和血糖的影响，结果表明ＡＬＸ糖尿病小鼠造模的最佳时间为禁食12、18ｈ后造模，禁食18ｈ糖尿病小鼠模型组为最好。但陈建国等[5]观察各种因素对四氧嘧啶制备小鼠糖尿病模型的影响，结果表明，四氧嘧啶致小鼠高血糖模型最佳条件为：四氧嘧啶腹腔注射剂量为200mg/Kg，给药前小鼠禁食16ｈ，选雌性小鼠更佳，选造模后第3天血糖值在15～30ｍmol/l小鼠为造模成功小鼠为宜。（2）大鼠Alloxan糖尿病大鼠是研究糖尿病治疗药物疗效的常用动物模型。但是，Alloxan糖尿病大鼠模型的制备受许多因素的影响，如饲料成分、给药次数、给药剂量、动物体重、个体差异等，如不能很好地控制这些因素，就会造成动物死亡率、转阴率高，以致模型的成功率降低，影响实验结果的可靠性。何学令等[6]观察四氧嘧啶制作大鼠糖尿病模型所需的最低剂量和不同给药途径对制作大鼠糖尿病模型的影响，结果表明，用四氧嘧啶制作大鼠糖尿病模型静脉给药优于腹腔给药；用四氧嘧啶以静脉给药方法成功制作大鼠糖尿病模型未禁食情况下需剂量≥40mg/kg。艾静等[7]探讨四氧嘧啶致Wistar大鼠高血糖模型的最佳实验条件，研究表明，实验选取雄性Wistar大鼠，体重190～240ｇ，在日照时间10ｈ以上且阳光充足的条件下饲养；给药方式采取两步给药法，剂量为120mg/kg第1天，1002mg/kg第2天，其成模率最高。（3）小型猪小型猪在解剖、生理学上与人较其它动物更为相似。因此，本动物模型与其它同类动物模型相比有独特的优点。刘军须等[8]将5%四氧嘧啶（alloxan）按200mg/kg体重经前腔静脉注射入小型猪体内，受试猪注射四氧嘧啶后，出现高血糖，糖耐量减低，糖尿，低蛋白血症，肾上腺皮质损伤，提示小型猪经前腔静脉注射四氧嘧啶（200mg/kg体重）可以建立Ⅰ型糖尿病模型。（4）家兔王开富等[9]用四氧嘧啶3种剂量（100,130.160mg/kg）于雌雄各半家兔中制作糖尿病模型，连续15d测定有关指标（血糖、尿糖、糖化血红蛋白）并观察动物死亡情况，结果发现，雌性家兔较雄性家兔耐受性强，死亡较少，故以四氧嘧啶130mg/kg于雌性家兔制作糖尿病模型最为适宜。2、链脲佐菌素（streptozotocin）链脲佐菌素能够选择性损伤胰岛β细胞，引起实验性糖尿病。给猴、狗、大鼠和小鼠等注射链脲佐菌素后，血糖水平的改变也可分为三个时相：①早期高血糖相，持续约1～2小时，乃此药抑制胰岛释放所致；②低血糖相，持续约6～10小时，可能是由于胰岛β细胞破坏，大量胰岛素释放，是血糖显著降低；③24小时后出现稳定的高血糖相即糖尿病阶段，此时大部分胰岛β细胞已呈现不同程度的损伤和破坏。与四氧嘧啶糖尿病不同，链脲佐菌素引起的糖尿病高血糖反应及酮症均较缓和。（1）小鼠[2]小鼠对此药敏感性较差，需静脉注射175～200mg/kg方可引起糖尿病。（2）大鼠于德民等[10]采用腹腔内1次注射60mg/kg体重STZ方法，建立了速发型链脲佐菌素Wistar大鼠糖尿病模型。采用每周1次连续3周腹腔内注射CFA（福氏完全佐剂）0.5m1和STZ（25mg/kg）方法，建立了迟发型Wistar大鼠糖尿病模型。迟发型Wistar大鼠糖尿病模型建立的可能的机理为：注射CFA后激活大鼠体内淋巴细胞，注射小剂量STZ后诱导胰岛β细胞发生轻度改变，在此基础上，来自脾细胞的被激活的具有细胞毒作用的T淋巴细胞将上述轻度变性的胰岛β细胞当作靶细胞进行攻击，从而导致自身免疫过程的发生，使胰岛β细胞损害加重。经过3周注射CFA和STZ，上述自身免疫作用不断被强化，使胰岛β细胞损伤由量变到质变，最终诱发大鼠糖尿病的发生。（3）豚鼠杨丽萍等[11]为建立豚鼠的I型糖尿病，给豚鼠腹腔注射链脲佐菌素（STZ）枸橼酸缓冲液200mg/kg，24h后每天定时皮下注射2U长效胰岛素，维持一定水平的血清胰岛素，6周后眼眶后静脉丛穿刺法采血5ml/只，测定血糖及血清胰岛素含量。结果表明，豚鼠血糖明显提高，血清胰岛素明显减少，认为该模型对研究I型糖尿病及其它相关疾病可能具有一定的价值。（4）树枸冼苏等[12]探讨链脲佐菌素(STZ)树枸糖尿病（DM）动物模型的建立及其空腹血糖（FBG）标准和最佳药物剂量，结果发现STZ能诱导树枸DM模型，树枸DM模型标准为FBG11.1mmol/L，最佳STZ剂量为150mg/kg。（三）手术及药物联合制作糖尿病模型通过手术切除实验动物较易切除的胰腺钩突及体尾部，然后局部或全身应用胰腺β细胞毒性药物，以破坏残留胰腺的β细胞，使其丧失功能，造成实验动物体内胰岛素缺乏，从而诱发实验动物出现糖尿病的临床症象。克服了全胰切除所致的严重创伤和胰腺外分泌障碍的缺点，也避免了大剂量应用胰腺β细胞毒性剂给其他组织器官带来的严重损伤。（四）病毒诱导方法[13]柯萨奇病毒（Coxsackievirus）多感染儿童，主要经肠道传播，引发胰腺炎，导致淋巴细胞浸润，β细胞坏死，可使新生的小白鼠、田鼠等致病，对成年鼠不致病。选用DBA2雌性小鼠，皮下接种脑炎、心肌炎病毒Ｍ型变异株，4～7ｄ后出现明显的高血糖，伴有血中及胰腺中胰岛素含量降低。其高血糖为特发性，伴有明显低胰岛素血症。在某些小鼠中可自然缓解，但糖耐量异常及高血糖在恢复期中仍将存在。3（五）自发性Ⅰ型糖尿病动物模型[13]自发性动物模型（spontaneousdiabetesanimalmodel）是动物自然发生的疾病，与人类某种疾病有相似之处，或通过遗传育种培养而保留下来的疾病动物。1、NOD小鼠（nonobesediabetesmouse）是JCL-ICR品系小鼠衍生的CTS（白内障易感亚系）糖尿病小鼠近亲杂交而来，其发病多突然，表现明显多饮、多尿、消瘦，血糖显著升高，不用胰岛素治疗，动物存活不了一个月，通常死于酮血症。NOD小鼠是自发性自身免疫I型糖尿病的一个很好的模型，是由T-细胞（包括CD4和CD8细胞）介导的，其发展受控于一系列T细胞的调节。β细胞损伤继发于自身免疫过程，引起低胰岛素血症。免疫调节剂，可溶性白介素1受体，可溶性TNF受体p55，高果糖饮食等可预防NOD小鼠糖尿病发作。NOD小鼠的糖尿病发病率与性别有关，雌性鼠发病率显著高于雄性鼠且发病早。2、BB糖尿病大鼠是从Wistar大鼠中筛选出来的一种自发性,遗传性C型糖尿病动物模型。其发病和自身免疫性毁坏胰腺β细胞引发胰腺炎及胰岛素缺乏有关。大鼠糖尿病发作是突然的，大约在60～120日龄时发病，数天后，糖尿病动物出现严重的高血糖，低胰岛素和酮血症。免疫抑制剂，将新生鼠胸腺切除等可预防糖尿病的发生，说明自身免疫参与发病。由于BB鼠能模拟人类Ⅰ型糖尿病的自然发病、病程发展和转归，且没有外来因素的参与和干扰，是一种十分理想的Ⅰ型糖尿病动物模型。3、LEW.1NR1/ztm-iddm大鼠是Lewis大鼠MHC单倍型自发突变株，自发性自身免疫Ⅰ型糖尿病动物模型。58ｄ左右发病，发病率为20%，性别不影响发病率。特点是高血糖、糖尿、酮尿和多尿。胰岛被炎性细胞（Ｂ淋巴细胞，Ｔ淋巴细胞，巨噬细胞，ＮＫ细胞）浸润。发生胰腺炎的部位β细胞迅速调亡。（六）转基因Ⅰ型糖尿病模型动物[14]研究者按照自己的意愿，借助于实验手段来控制实验动物的特定基因组分及其表达等，而使动物表现特有的遗传性状，此称之为转基因技术，运用此技术干预的动物称为转基因动物。已运用基因转移技术证实动物发生Ⅰ型糖尿病与MHC基因异常、病毒感染、T细胞介导胰岛β细胞损伤等有关。关于Ⅰ型糖尿病的转基因动物模型已有报道。二、Ⅱ型糖尿病动物模型的建立（一）化学药物损伤所致Ⅱ型糖尿病模型1.一次性大剂量链脲佐菌素（STZ）注射造模STZ对一定种属胰岛β细胞选择性的破坏，可使许多动物产生糖尿病。由于其对组织毒性较小，动物存活率高，所以是目前国内外使用较多的一种制备糖尿病动物模型的方法。有报道：给予小鼠STZ65mg/kg体重，可致空腹血糖明显上升，不同剂量和不同时期给予STZ可造成不同严重程度的Ⅱ型糖尿病。2.多次小剂量STZ注射造模多次小剂量注射STZ制得的模型与T淋巴细胞介导的β细胞不断破坏有关。由于糖尿病除表现胰岛β细胞分泌缺陷及组织对胰岛素作用的抵抗外，糖代谢紊乱及伴发的脂肪代谢紊乱也是其重要特征。尤其是Ⅱ型糖尿病，高糖血症和高脂血症为其主要表现。（1）金黄地鼠乔凤霞等[15]给金黄地鼠连续腹腔注射小剂量链脲佐菌素3天，剂量为40mg/kg，于注射后1、2、3、4、8周测动物血糖、血脂，并用降血糖药二甲双胍和调节血脂药普罗布考验证了该模型的反应性，结果表明，该方法处理的金黄地鼠可作为同时评价药物降血糖作用和调节血脂作用的动物模型。（2）大鼠[16]用STZ处理的新生大鼠成年后将呈典型的Ⅱ型糖尿病表现。自发性高血压鼠（SHR）在新生期予以STZ处理，成年可获得Ⅱ型糖尿病合并原发性高血压模型。（二）STZ加膳食诱导的模型Ⅱ型糖尿病的基本病变是胰岛素分泌减少和胰岛素抵抗。给予实验动物少量STZ，4破坏一部分胰岛β细胞功能，同时饲以高脂肪饲料造成外周组织对胰岛素不敏感，两者结合便诱导出接近人类Ⅱ型糖尿病的动物模型。1.小鼠王彤等[17]用高脂肪饲料喂养Ｃ57BL/6Ｊ雄性断乳小鼠3周，腹腔注射链脲佐菌素（STZ），继续喂养4周，实验结束时测定各相关指标，结果表明，实验结束时高脂饲料实验组小鼠表现出明显的高血糖和正常胰岛素水平，整个代谢变化缓慢，而Ｃ57BL/6Ｊ小鼠较以往所用的db/db或ob/ob小鼠容易得到，建模方法简便，费用较