细菌对抗菌药物的敏感试验

细菌的耐药性监测与抗菌药物压力河南省卫生厅临床检验中心金雨琦第一节细菌的耐药性监测细菌的耐药性监测——药敏试验概念：细菌对抗菌药物的敏感试验（简称药敏试验）是测定某一菌株对某种抗菌药物是敏感还是耐药的一种体外监测试验。一、药敏试验的意义和目的意义：大剂量、长疗程——造成对机体的伤害；小剂量、短疗程——诱发耐药菌株的产生。因此，在使用抗菌药物的过程中，必须加强细菌对抗菌药物敏感性的实验室监测，为临床上合理使用抗菌药物提供试验依据。而细菌对抗菌药物的敏感试验，就是对抗菌药物进行实验室监测的主要手段之一。目的：1、为临床上治疗某个病人选择最佳抗菌药物，指导临床用药，避免由于用药不当，导致耐药菌株产生或造成人体伤害；2、进行流行病学调查，了解致病菌的耐药变迁情况，为医疗行政主管部门的决策提供依据；3、用于某些细菌的鉴别和鉴定：如Optochin敏感试验、杆菌肽敏感试验和新生霉素敏感试验，分别用于鉴定不同的细菌；4、评价新抗菌药物的抗菌谱及抗菌活性等药效学特性。二、敏感和耐药的概念一般认为，某菌株能被某种抗菌药物抑制或杀灭，则该菌株对该抗菌药物敏感；反之，则为耐药。上述概念虽然考虑到了细菌对抗菌药物的敏感性，但却忽略了药物的剂量、浓度和机体的耐受性。从本质上讲：细菌对某种抗菌药物是敏感还是耐药，常以该抗菌药物的治疗浓度（抗菌药物通过常用途径和常用剂量所能达到的血药浓度）与该抗菌药物对细菌的最小抑菌浓度（MIC）的关系而定：若某抗菌药物对某菌株的最小抑菌浓度（MIC）小于该抗菌药物的治疗浓度，则为“敏感”（S,Sensitive）；若某抗菌药物对某菌株的最小抑菌浓度（MIC）大于该抗菌药物的治疗浓度，则为“耐药”（R,Resistant）；若MIC介于治疗浓度的上下限之间，则为“中介度”（I,Intermediate）。1、MIC（Minimuminhibitoryconcentration）所谓MIC，就是某抗菌药物对某菌株的最小抑菌浓度。其测定方法是：（1）、取一列洁净无菌的小试管，各管分别加营养肉汤1ml；（2）、第一管加入含1280U/ml的抗菌药物原液1ml,后倍比稀释至次末管后吸出1ml弃去；（3）、各管分别加入试验菌液0.1ml;（4）、置37℃孵箱中培养18～24h，观察结果。抗菌药物原液（1280U/ml）1ml1ml1ml弃去6403201608040201052.51.250药物浓度U/ml结果观察：含最小药物量仍呈明显不混浊的一管所含的药物浓度即为该抗菌药物对试验菌株的最小抑菌浓度（MIC）。2、血药浓度（血清中抗菌药物的浓度）在使用各类抗菌药物时，常常会遇到的一个重要问题，就是血药浓度。例如：口服抗菌药物总是经肠道逐渐吸收入血的。因此，血液中的药物浓度是从无到有随时间的延长逐渐增高的。即使静脉注射抗菌药物，因存在着首过效应（第一关卡效应）和肾脏的排泄作用，血药浓度也是随着注射的次数而逐渐增高的。3、血药浓度与MIC之间的关系致死量中毒浓度最小中毒量极量R治疗安全范围治疗浓度（常用剂量）IS最小有效量无效浓度血药浓度MIC当MIC小于血药浓度中治疗浓度的下限时，则称为“敏感”，用“S”（Sensitive）表示。当MIC大于治疗浓度的上限时，则为“耐药”，用“R”（Resistant）表示。当MIC介于治疗浓度的上下限之间时，则为“中介度”，用“I”（Intermediate）表示。但是药物在局部组织和组织液中的浓度，往往只有血清浓度的1/2～1/10，故在治疗局部组织感染时，仅仅以MIC小于血清治疗浓度定为敏感往往会产生一定的误差，应该以MIC小于血清治疗浓度的2～10倍，才是敏感。因此，在治疗局部组织或组织液感染选用抗菌药物时，一般治疗剂量，至少应该是抗菌药物对病原菌的MIC的3～5倍。目前，临床上选择抗菌药物，常根据抑菌商数来选择。所谓“抑菌商数”（InhibitoryQuotient，简称IQ），是指某抗菌药物在局部组织或体液中的浓度除以该药物对感染菌的最小抑菌浓度所得的商数。即：局部组织或体液中的药物浓度IQ=MIC抑菌商数越大，抑菌效果越明显；反之，抑菌商数越小，抑菌效果越差。三、细菌耐药性检测的常用方式标准结果判读表纸片法药敏试验纸片含药量和结果解释以及MIC测定结果解释抑菌环直径（mm）MIC（µg/ml）抗菌药物纸片含药量耐药中介度敏感耐药中介度敏感β内酰胺类：青霉素族青霉素不产青霉素酶葡萄球菌10U≤28—≥29≥0.25—≤0.12肠球菌属细菌10U≤14——≥16—≤8链球菌属细菌10U≤19—≥28≥40.25—2≤0.12淋病奈瑟菌10U≤2627—46≥47≥2—≤0.06甲氧苯青霉素1µg≤910—13≥14≥16—≤8苯唑青霉素1µg≤1011—12≥13≥4—≤2分界点的计算方法选取一大群同种不同株的细菌做药敏试验（至少选取100株，包括敏感菌株和耐药菌株），求出该群细菌中每一菌株对某抗菌药物的MIC及其相应的抑菌环直径。因抗菌药物对细菌的MIC与其相应的抑菌环直径呈负相关关系，据此可绘制回归直线图。方法如下：（1）、用试管稀释法分别检测某抗菌药物对试验菌各菌株的MIC；（2）、用含一定量该抗菌药物的药敏纸片，以扩散法分别测出（1）项中各菌株相应的抑菌环直径；（3）、以MIC的对数（为计算方便，可采取以2为底的对数）为纵坐标；以抑菌环直径为横坐标，在坐标纸上绘制lgMIC与抑菌环直径的散点图；氨苄青霉素对肠杆菌科的抑菌试验0102030405005101520Diameter（mm）lgMIC系列1氨苄青霉素对肠杆菌科的抑菌试验0102030405005101520Diameter（mm）lgMIC系列1氨苄青霉素对肠杆菌科的抑菌试验0102030405005101520Diameter（mm）lgMIC系列1第二节抗菌药物压力一、抗菌药物压力是细菌产生耐药的主要源动力。1985年，著名学者McGowan指出了与医院内细菌耐药性的出现相关的7个方面：（1）引起医院感染的微生物的耐药性比引起社会感染的微生物的耐药性更多见；（2）医院中耐药菌株感染者使用的抗菌药物比敏感株感染或定植者使用的抗菌药物多；（3）抗菌药物使用情况的变化会引起细菌耐药情况的变化，如投入或停用某种抗菌药物常与其耐药性的消长有关；（4）抗菌药物使用愈多的区域耐药菌分布愈多；（5）抗菌药物应用时间越长耐药菌定植的可能性越大；（6）抗菌药物剂量越大耐药菌定植或感染的机会更多；（7）抗菌药物对自身菌群有影响并有利于耐药菌生长。二、抗菌药物作用的基本机理抗菌药的作用机理主要有以下5种1、抑制细胞壁的合成这些药物主要选择性作用于某些有细胞壁的真菌、细菌，而对宿主本身没有毒性作用。这些药物包括青霉素（Penicillins）、头孢菌素（Cephalosporins）、万古霉素（Vancomycin）、杆菌肽（Bacitracin）、异烟肼（Isoniazid）、乙胺丁醇（Ethambutol）等。它们主要通过抑制细胞壁的主要成分——肽聚糖的合成，从而引起细胞壁的通透性改变，大量水分进入细胞浆中而引起细胞的裂解。2、抑制蛋白质的转录或合成由于真核生物和原核生物核糖体的差异，真核生物的核糖体主要是80S，由60S和40S两个亚基组成，而原核生物的核糖体是70S，主要由30S和50S两个亚基组成。属于这一种作用机制的主要抗菌药包括氨基糖苷类（Aminoglycosides），如链霉素(Streptomycin)、阿米卡星（Amikacin）、托普霉素（Tobramycin）、庆大霉素（Gentamicin）等，它们主要作用于核糖体的30S亚基，改变它的形状，导致mRNA不能被正常地翻译而引起蛋白质合成受阻，从而引起细菌死亡。3、破坏胞浆膜的完整性这类抗菌药主要是一些抗真菌的药物，如两性霉素B（AmphotericinB），它们主要能够与细菌细胞胞浆膜上的一些磷脂成分结合，破坏胞浆膜的完整性，从而导致细胞的裂解。4、影响细菌的代谢途径这类抗菌药的代表就是磺胺类（Sulfonamides）。5、抑制核酸的合成这类药物主要包括一些核苷酸的类似物，它们可以插入到DNA或RNA链中，导致DNA或RNA复制过程中的错配，而干扰其正常的功能。另外一些药物，如喹诺酮（Quinolones）、氟喹诺酮（Fluoroquinolones）可以特异性地抑制DNA旋转酶的活性，抑制细菌DNA复制时的解螺旋，导致DNA复制的受阻。三、细菌耐药性产生的机理细菌的耐药性机理主要有生化机理和基因机理两个方面：(一）、生化机理：1、细菌产生破坏药物结构的酶这一类的耐药细菌常常可以产生一种或多种水解酶或钝化酶来水解或修饰进入细菌细胞内的药物，使之失去生物活性。这是引起细菌耐药性的最重要的机制，目前发现和分离的钝化酶主要有以下4种：（1）β-内酰胺酶(β-Lactamase)。它是细菌对β-内酰胺类抗菌药耐药的主要原因，由于β-内酰胺酶的产生，使其β-内酰胺环的酰胺键断裂而失去抗菌活性。该类酶可以为染色体介导，也可为质粒介导。Bush根据底物及酶抑制剂的作用类型将β-内酰胺酶分为4种，即A组β-内酰胺酶(主要水解青霉素类)，B组金属酶(其活性部分是结合锌离子的硫醇)，C组β-内酰胺酶(主要水解头孢菌素类)，D-组β-内酰胺酶(苯唑西林水解酶)。（2）氨基糖苷类钝化酶。细菌对氨基糖苷类(Aminoglycosides)抗生素产生耐药性的最重要的原因就是产生了对这一类药物的共价修饰酶。这些酶通过磷酸化、乙酰化和腺苷酸化等途径对其进行修饰而使其灭活。目前，这一类的共价修饰酶主要有磷酸转移酶（O-phosphotransferases,APHs）,腺苷酸转移酶（O-adenyltransferases，ANTs）和N-乙酰转移酶（N-acetyltransferases，AACs）3类。现在已经对这些酶的晶体结构有了清楚的研究。（3）氯霉素乙酰转移酶。此酶为一种胞内酶，早在1987年，Lyon等就确定此酶由质粒或染色体或转座子基因编码，主要作用是使氯霉素类抗生素转化为无抗菌活性的代谢物。（4）红霉素酯化酶。此酶是一种体质酶，由质粒介导，主要作用是水解红霉素及大环内酯类抗生素结构中的内酯而使之失去抗菌活性。2、靶位的改变由于抗菌药作用的靶位(如核糖体和核蛋白)发生突变或被细菌产生的某种酶修饰而使抗菌药物无法发挥作用，以及抗菌药的作用靶位(如青霉素结合蛋白和DNA回旋酶)结构发生改变而使之与抗生素的亲和力下降，这种耐药机制在细菌耐药中普遍存在。目前的研究表明，β-内酰胺类抗菌药物的作用靶位为青霉素结合蛋白(PBP),氨基糖苷类和四环素抗菌药物的作用靶位为核糖体的50S亚基，大环内酯类和氯霉素以及克林霉素的作用靶位为核糖体的30S亚基，利福霉素类的作用靶位为依赖于DNA的RNA聚合酶，哇诺酮类的作用靶位为DNA促旋酶，磺胺类的作用靶位为二氢碟酸合成酶和二氢叶酸还原酶，万古霉素的作用靶位为细胞壁五肽末端的D-丙氨酰-D-丙氨酸末端的游离羧基。这些作用靶位结构的细微变化都有可能产生很高的耐药性。3、渗透屏障由于细菌细胞壁的障碍或细胞膜通透性的改变，形成一道有效屏障，抗菌药无法进入细胞内达到作用靶位而发挥抗菌效能，这也是细菌在进化与繁殖过程中形成的一种防卫机制。这类耐药机制是非特异性的，主要见于革兰氏阴性菌。因为革兰氏阴性菌细胞壁黏肽层外面存在着类脂双层组成的外膜，外层为脂多糖，由紧密排列的碳氮分子组成，阻碍了疏水性抗菌药进入菌体内。而在革兰氏阳性菌中细胞膜被一层厚厚的肽聚糖细胞壁所包裹。尽管细胞壁具有很强的机械强度，但由于其结构比较粗糙，几乎不影响抗菌药物这样的小分子物质扩散至细胞内。4、药物主动外排系统药物的主动外排系统被认为是导致广泛的细菌对多种抗生素产生耐药性的重要原因。目前研究表明主要有两大类外排系统：特异性（单一性）外排系统和多种