粟酒裂殖酵母发酵菊芋生产燃料乙醇试验

２０１０年１月农业机械学报第４１卷第１期ＤＯＩ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１０００１２９８．２０１０．０１．０２１粟酒裂殖酵母发酵菊芋生产燃料乙醇试验汪伦记１，２　董　英１（１江苏大学食品与生物工程学院，镇江２１２０１３；２河南科技大学食品与生物工程学院，洛阳４７１００３）　　【摘要】　以菊粉为原料，研究了粟酒裂殖酵母的乙醇发酵性能，并考察了温度、初始ｐＨ值和菊粉质量浓度对乙醇发酵的影响，进而研究了粟酒裂殖酵母发酵菊芋汁和菊芋粉生产乙醇的情况。结果表明：粟酒裂殖酵母能发酵菊粉高产乙醇；该菌株最适发酵温度为３０℃，最适初始ｐＨ值为４０，在此条件下，菊粉质量浓度２００ｇ／Ｌ时，乙醇质量浓度达到７４５８ｇ／Ｌ，理论转化率为８１２４％；直接发酵菊芋汁和菊芋粉获得更高的乙醇产率，理论转化率分别达到８４０２％和８６０９％。关键词：菊芋　粟酒裂殖酵母　同步糖化发酵　乙醇发酵中图分类号：Ｓ２１６２文献标识码：Ａ文章编号：１０００１２９８（２０１０）０１０１０６０５ＥｔｈａｎｏｌＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎｆｒｏｍＪｅｒｕｓａｌｅｍＡｒｔｉｃｈｏｋｅＵｓｉｎｇＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｐｏｍｂｅＷａｎｇＬｕｎｊｉ１，２　ＤｏｎｇＹｉｎｇ１（１ＳｃｈｏｏｌｏｆＦｏｏｄａｎｄＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＪｉａｎｇｓｕＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｚｈｅｎｊｉａｎｇ２１２０１３，Ｃｈｉｎａ　２ＳｃｈｏｏｌｏｆＦｏｏｄａｎｄＢｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＨｅｎａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｌｕｏｙａｎｇ４７１００３，Ｃｈｉｎａ）ＡｂｓｔｒａｃｔＴｈｅｅｔｈａｎｏｌｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｃａｐａｂｉｌｉｔｙｏｆＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｐｏｍｂｅｆｒｏｍｉｎｕｌｉｎｗａｓｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ．Ｔｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ，ｉｎｕｌｉｎｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ，ａｎｄｉｎｉｔｉａｌｐＨｖａｌｕｅｏｎｔｈｅｅｔｈａｎｏｌｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｗｅｒｅｓｔｕｄｉｅｄ．ＴｈｅｅｔｈａｎｏｌｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｆｒｏｍＪｅｒｕｓａｌｅｍａｒｔｉｃｈｏｋｅｊｕｉｃｅａｎｄｆｌｏｕｒｗｅｒｅｆｕｒｔｈｅｒｓｔｕｄｉｅｄ．ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔＳ．ｐｏｍｂｅｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄｇｏｏｄｅｔｈａｎｏｌｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ．ＴｈｅｏｐｔｉｍｕｍｉｎｉｔｉａｌｐＨｖａｌｕｅｗａｓ４０，ａｎｄｔｈｅｏｐｔｉｍｕｍｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｗａｓ３０℃．Ｕｎｄｅｒｔｈｅｏｐｔｉｍａｌｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ，ｔｈｅｍａｘｉｍｕｍｅｔｈａｎｏｌｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆ７４５８ｇ／Ｌ，ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔｔｏ８１２４％ｏｆｔｈｅｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌｙｉｅｌｄ，ｗａｓｒｅａｃｈｅｄｆｒｏｍ２００ｇ／Ｌｉｎｕｌｉｎｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎａｆｔｅｒ７２ｈｏｆｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ．Ｈｉｇｈｅｒｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎｒａｔｅｓｏｆ８４０２％ａｎｄ８６０９％ｗｅｒｅｏｂｔａｉｎｅｄｗｈｅｎＪｅｒｕｓａｌｅｍａｒｔｉｃｈｏｋｅｊｕｉｃｅａｎｄｆｌｏｕｒｗｅｒｅｄｉｒｅｃｔｌｙｕｓｅｄｉｎｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ　Ｊｅｒｕｓａｌｅｍａｒｔｉｃｈｏｋｅ，Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｐｏｍｂｅ，Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｓａｃｃｈａｒｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ，Ｅｔｈａｎｏｌｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ收稿日期：２００９０４２８　修回日期：２００９０９２７镇江市农业攻关项目（ＮＹ２００６０４３）作者简介：汪伦记，博士生，河南科技大学讲师，主要从事微生物与发酵工程研究，Ｅｍａｉｌ：[e-mail]通讯作者：董英，教授，博士生导师，主要从事食品功能因子和食品生物技术研究，Ｅｍａｉｌ：[e-mail]　　引言菊芋（Ｊｅｒｕｓａｌｅｍａｒｔｉｃｈｏｋｅ），俗名洋姜，原产北美，目前在中国广泛种植。菊芋块茎富含菊粉，占其干质量的６８％～８３％［１］。菊粉是果糖经β２，１糖苷键聚合而成的一种果聚糖，呈直链结构，末端常含有一个葡萄糖基［２］，常用来生产高果糖浆［３］，也可以用来生产乙醇［４～５］。菊芋适应性强，耐贫瘠、耐寒、耐旱，特别适合在沙漠、滩涂、盐碱荒地等非农业耕地种植，且产量高，价格低廉。作为一种果糖基能源植物，菊芋与小麦、玉米等粮食类淀粉质原料相比，具有不占耕地、无需液化等优势，是我国非粮燃料乙醇生产及其产业规模化发展可选择的原料之一［６］。以菊芋为原料生产乙醇很早就受到国内外的关注。２０世纪５０年代以来，国内外学者先后报道了各种以菊粉为原料生产乙醇的工艺技术［７～１０］，包括首先酸解或酶解菊粉生成单糖，再利用酿酒酵母发酵生成乙醇的分步糖化发酵工艺（ＳＨＦ）和利用产菊粉酶的微生物与酿酒酵母进行混合培养的同步糖化发酵工艺（ＳＳＦ）。本文使用粟酒裂殖酵母（Ｓ．ｐｏｍｂｅ）进行单菌同步糖化发酵菊芋生产燃料乙醇的试验。１　材料和方法１１　材料１１１　菌种粟酒裂殖酵母购自中国工业微生物菌种保藏管理中心；酿酒酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ，耐高温和耐高糖）购自湖北安琪酵母公司；酿酒酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）和马克斯克鲁维酵母（Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ）为实验室保存。１１２　菊芋粉和菊粉菊芋购自安徽省滁州市，鲜菊芋经洗净、切片、晾晒、干燥、粉碎后置于干燥环境中保存备用；菊粉，购自北京威德生物科技有限公司。１１３　培养基（１）斜面培养基。豆芽汁蔗糖琼脂培养基，接种一环菌种于豆芽汁蔗糖琼脂斜面培养基，３０℃，培养７２ｈ，储于４℃冰箱备用。（２）种子培养基Ｓ．ｐｏｍｂｅ和Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ：菊粉２０ｇ／Ｌ，酵母膏１５ｇ／Ｌ，蛋白胨２０ｇ／Ｌ，ｐＨ值４６；Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ：豆芽汁蔗糖培养基。１２１℃灭菌２０ｍｉｎ备用。（３）发酵培养基三角瓶发酵：菊粉（按试验要求配制所需质量浓度，ｇ／Ｌ），酵母膏１５ｇ／Ｌ，蛋白胨２０ｇ／Ｌ，除特别指出外，初始ｐＨ值均用稀盐酸调节至４０，１１５℃灭菌３５ｍｉｎ。５Ｌ发酵罐：菊芋汁、菊芋粉配成的培养基，用稀盐酸调节初始ｐＨ值至４０，１１５℃灭菌３５ｍｉｎ。１２　试验方法１２１　种子液的制备酵母接入种子培养基中，３０℃振荡培养４８ｈ，使细胞浓度达到１×１０８个／ｍＬ以上。１２２　Ｓ．ｐｏｍｂｅ的乙醇发酵性能每个三角瓶装入１００ｍＬ、２００ｇ／Ｌ菊粉发酵液，分别接入乙醇发酵菌种，接种量５％，３０℃静止培养，定时称量，记录ＣＯ２失重，估计发酵状况。发酵结束后，全部倒入全玻璃蒸馏器进行乙醇蒸馏，测定乙醇含量，对比Ｓ．ｐｏｍｂｅ和Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ的乙醇发酵性能。１２３　温度对乙醇发酵的影响配制２００ｇ／Ｌ菊粉发酵液，接入Ｓ．ｐｏｍｂｅ，接种量５％，分别在２５、２８、３０、３３和３７℃培养７２ｈ，进行乙醇发酵，考察温度对乙醇发酵的影响，确定最佳发酵温度。１２４　初始ｐＨ值对乙醇发酵的影响配制２００ｇ／Ｌ菊粉溶液，初始ｐＨ值分别为３５、４０、４５、５０、５５，接种量５％，３０℃培养７２ｈ，考察ｐＨ值对乙醇发酵的影响，确定最佳ｐＨ值。１２５　菊粉质量浓度对乙醇发酵的影响选择１５０、２００、２５０和３００ｇ／Ｌ４种菊粉质量浓度进行试验，接种量５％，３０℃培养７２ｈ，研究乙醇得率，确定最佳原料质量浓度。１２６　菊芋汁发酵鲜菊芋加适量水，粉碎打浆，纱布过滤去除残渣，菊芋汁８０℃加热１５ｍｉｎ灭酶，以防褐变，蒸发浓缩至总糖质量浓度为２００ｇ／Ｌ，接种发酵，接种量５％，温度３０℃，转速２００ｒ／ｍｉｎ。１２７　菊芋粉发酵以１００目筛分菊芋粉为底物进行乙醇发酵，菊芋粉质量浓度２００ｇ／Ｌ，温度３０℃，转速２００ｒ／ｍｉｎ，接种量５％。１３　分析方法（１）乙醇质量浓度的测定［１１］：ＨＰ４８９０Ｄ气相色谱工作站，填料ＰｏｒａｐａｋＱ粒度８０～１００目，长２ｍ，外径３ｍｍ，内径２ｍｍ。气化室、色谱柱及热导检测器的温度分别为１５０、１２０、１５０℃。理论转化率［１２］为Ｔｔ＝ＣＥ０５１Ｃｆ×１００％式中　ＣＥ———乙醇的质量浓度，ｇ／ＬＣ———菊粉或菊芋粉质量浓度，ｇ／Ｌｆ———威德菊粉或菊芋粉中初始总糖质量分数（总糖质量分数定义为原料中菊粉和还原糖质量分数总和，试验测定菊芋粉中总糖质量分数为７５％，威德菊粉为９０％）其中糖转换为乙醇的换算系数为０５１。（２）还原糖和总糖的检测：还原糖测定采用ＤＮＳ比色定糖法［１３］；总糖测定以还原糖计，定量待测样品于００５ｍｏｌ／ＬＨＣｌ中，沸水浴中回流水解１ｈ，用００５ｍｏｌ／ＬＮａＯＨ调成中性［９］。７０１第１期　　　　　　　　　　　　汪伦记等：粟酒裂殖酵母发酵菊芋生产燃料乙醇试验（３）酶活测定［１４］：０５ｍＬ酶液（若必要，适当稀释）加入到４５ｍＬ质量分数２％的蔗糖溶液（ｐＨ值４８的０２ｍｏｌ／Ｌ醋酸缓冲液配制），５５℃反应１０ｍｉｎ，沸水灭活。ＤＮＳ法测还原糖含量。外切菊粉酶活力定义为：以蔗糖为底物，每分钟水解１μｍｏｌ蔗糖所需的酶量为一个酶活力单位。（４）酵母浓度的测定［１５～１６］：采用血球板计数，活细胞浓度测定采用美兰染色。２　结果与讨论２１　Ｓ．ｐｏｍｂｅ的乙醇发酵性能Ｓ．ｐｏｍｂｅ和Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ发酵菊粉产乙醇对比试验结果，如表１所示。由表１可知，Ｓ．ｐｏｍｂｅ乙醇发酵能力高于Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ，其乙醇质量浓度达到７３６４ｇ／Ｌ，理论转化率为８０２１％；而Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ的乙醇质量浓度和理论转化率只达到４０ｇ／Ｌ和４０％左右，且其发酵时间比Ｓ．ｐｏｍｂｅ长。出现这种现象的原因是由于Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ不能直接发酵菊粉产乙醇，只有Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ分泌胞外的菊粉外切酶先把菊粉分解成果糖，然后Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ再发酵果糖生成乙醇，在这个过程中，Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ分泌菊粉外切酶与Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ发酵果糖无法达到协调一致，而Ｓ．ｐｏｍｂｅ发酵菊粉生产乙醇过程中糖化和发酵同步完成。Ｏｈｔａ［１７］，Ｎａｋａｍｕｒａ［９］和Ｓｚａｍｂｅｌａｎ［１０］等人利用高产菊粉外切酶的微生物，如Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ和Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓｆｒａｇｉｌｉｓ和乙醇发酵性能优良的Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ进行混合发酵菊粉产乙醇，并达到较高乙醇产量，理论转化率也达到８０％以上。但由于糖化和乙醇发酵分别由两种微生物完成，造成发酵周期较长，需要５ｄ以上，而Ｓ．ｐｏｍｂｅ仅需７２ｈ。以菊粉为原料进行燃料乙醇的工业化生产中，Ｓ．ｐｏｍｂｅ的同步糖化发酵比混菌发酵的同步糖化发酵相比，减少了发酵环节，缩短发酵周期。表１　Ｓ．ｐｏｍｂｅ或Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ的菊粉乙醇发酵Ｔａｂ．１　ＥｔｈａｎｏｌｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｆｒｏｍｉｎｕｌｉｎｂｙＳＳＦｕｓｉｎｇＳ．ｐｏｍｂｅｏｒＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　　　菌株乙醇质量浓度／ｇ·Ｌ－１理论转化率／％发酵时间／ｈＫ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ＋Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（ｔｈｅｒｍａｌｔｏｌｅｒａｎｃｅ）３９０２４２５１１６８Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ＋Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（ｓｕｇａｒｔｏｌｅｒａｎｃｅ）３７８５４１２３１４４Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ＋Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ４１８９４５６３１２０Ｓ．ｐｏｍｂｅ７３６４８０２１７２２２　乙醇发酵进程中菊粉酶酶活和Ｓ．ｐｏｍｂｅ增长在以菊粉为原料发酵生成乙醇的过程中，菊粉酶控制菊粉生成果糖，因此发酵过程中菊粉酶的活性会影响对菊粉的水解，进而可能影响乙醇产量和发酵进程。为此，对Ｓ．ｐｏｍｂｅ利用菊粉（２００ｇ／Ｌ）生产乙醇过程中菊粉酶酶活性进行了研究，结果如图１所示。从图中可以看出，在乙