my-免疫共沉淀技术及应用

GEHealthcareLifeSciences免疫共沉淀技术及应用免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation,IP）原理：免疫共沉淀技术(也被称为免疫共吸附或者免疫下拉技术)能够从原始的细胞裂解物中分离并富集目标蛋白。免疫共沉淀是利用抗原和抗体特异性结合以及细菌的ProteinA/G特异地结合到免疫蛋白的Fc片段的现象开发出来的方法。其原理是，在细胞裂解液中加入抗目的蛋白的抗体，孵育后再加入与抗体特异结合的结合于sepharosebeads上的proteinA/G，与细胞中有目的蛋白结合，就形成一种复合物：“目的蛋白/目的蛋白-抗目的蛋白抗体-proteinA/G，经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，复合物又被分开。然后经免疫印迹或质谱检测目的蛋白。这种方法得到的目的蛋白是在细胞内与目的蛋白天然结合，符合体内实际情况，得到的结果可信度高。这种方法常用于检测两种目的蛋白是否在体内结合，也可用于一种特定蛋白质的新的作用搭档。免疫共沉淀实验的操作步骤比较多，同时由于在非变性条件下进行实验，所以要得到一个完美的实验结果，不仅需要高质量的抗体，同时对免疫沉淀体系也需要有严格的控制指标。免疫沉淀实验：从蛋白样品处理；抗体-Sepharosebeads复合物洗涤到最后的鉴定，每步都非常关键，需要严格控制实验流程中每个关键步骤的质量，才能达到最终的实验目的。免疫共沉淀实验流程为：（1）蛋白样品准备：如果为细胞样品，需先裂解细胞；（2）抗原抗体结合反应；（3）ProteinA/G与抗原抗体复合物结合GEHealthcareLifeSciences（4）免疫复合物与proteinA/G解离：一般采用2%SDS煮沸5分钟处理样品；（5）分析鉴定：应用SDS-PAGE，western-blotting或质谱仪分析鉴定样品应用领域：免疫共沉淀一般用于低丰度蛋白的富集和浓缩，为SDS-PAGE和MS质谱分析鉴定准备样品。ProteinAMagSepharose、ProteinGMagSepharose和NHSMagSepharose是设计用于简化免疫沉淀或pull-down目标蛋白富集的磁珠。固定到MagSepharose磁珠的抗体或其他蛋白用于捕获目标蛋白，之后利用磁力装置收集磁珠。GE公司针对免疫沉淀的mag产品分为以上两种，两类填料的具体实验操作的方案也不相同：1、常用操作填料ProteinAMagSepharose™/ProteinGMagSepharose，两者对单克隆或多克隆抗体都具有高度亲和力。固定到MagSepharose填料的ProteinA和ProteinG配体上的抗体被用于捕获与抗体结合的目的蛋白复合物，富集目的蛋白用于质谱或电泳分析。2、需交联操作填料NHSMagSepharose：NHSMagSepharose被设计用于任何含有自由胺基的蛋白或其他生物分子的共价交联，且被用于各种类型的pull-down实验。产品需要先偶联抗体或配体，偶联后的产品再与抗体或配体结合的目的蛋白复合物结合并富集目的蛋白用于质谱或电泳分析。MagSepharose磁珠的关键优势是：1、可见且稠密，很容易点样和收集结合的目标蛋白；2、非粘附型磁珠消除了弥散效应和聚合物的形成，无需去污剂就可以使用；3、目标蛋白以小或大样品体积被快速捕获(低至微升，高至毫升)4、优化的容量用于目标蛋白的富集/免疫沉淀-只需要少量的抗体GEHealthcareLifeSciences5、具有可优化用于电泳和MS分析的灵活的洗脱条件步骤另外，实验室常用的琼脂糖基质的ProteinA/G产品也可用于免疫共沉淀的应用。一般应用proteinA/G产品免疫沉淀的实验流程如图所示。更多的磁珠应用可以登录网站下载。•ProterinA/G或NHS磁珠•抗体结合或交联或耦合•结合目标蛋白•清洗•洗脱