脉冲磁场逆转乳腺癌细胞多药耐药性的作用研究

2008年第35卷第21期脉冲磁场逆转乳腺癌细胞多药耐药性的作用研究*张翠宁刘晓秋韩英赵阿津宋保民北京协和医学院中国医学科学院放射医学研究所（天津市300192）摘要目的：研究脉冲磁场（PulsedMagneticFields，PMF）对乳腺癌耐药细胞株MCF-7/ADR的逆转作用。方法：采用MTT实验方法，分别检测不同频率及不同磁场强度条件照射下的MCF-7/ADR细胞的耐药倍数和逆转倍数。用流式细胞术检测经脉冲磁场照射后MCF-7/ADR细胞中Rh123药物蓄积量变化。用流式免疫荧光技术检测膜经脉冲磁场照射后MCF-7/ADR细胞膜表面P-糖蛋白（P-gp）和多药耐药相关蛋白（MRP1）表达情况。采用半定量RT-PCR（逆转录-聚合酶链反应）检测经脉冲磁场照射后MCF-7/ADR细胞中MDR1和MRP1基因表达情况。建立人乳腺癌耐药细胞株MCF-7/ADR裸鼠移植瘤模型，通过测量肿瘤体积及重量观察PMF对肿瘤细胞的体内逆转作用。结果：脉冲磁场能有效逆转乳腺癌耐药细胞株MCF-7/ADR对阿霉素产生的耐药性（P0.01），其中110Hz，40mT照射条件逆转效果最好，可达5倍左右；脉冲磁场能提高罗丹明123在细胞内的蓄积量，其中110Hz，40mT照射条件下可有效提升20%左右药物蓄积量；细胞经脉冲磁场照射后，膜表面耐药蛋白P糖蛋白表达量明显下降，MRP1蛋白表达量变化不明显；编码上述两种耐药蛋白的耐药基因表达量均明显下降；此外，脉冲磁场联合阿霉素可有效逆转裸鼠移植瘤的生长增值（P0.01）。结论：PMF具有逆转体外和体内乳腺癌细胞多药耐药性的作用。关键词脉冲磁场（PMF）MCF-7/ADR多药耐药裸鼠MDR1MRP1􀆽本文课题受国家自然科学基金资助（编号：30570437）通讯作者：刘晓秋[e-mail]dMagneticFieldsonBreastCancerCellLineMCF-7/ADRinVitroandinVivoZHANGCuining,LIUXiaoqiu,HANYing,ZHAOAjin,SONGBaominCorrespondingauthor:LIUXiaoqiu,E-mail:[e-mail]kingUnionMedicalCollege,Tianjin300192,ChinaGrantsupport:NationalNaturalScienceFoundationofChina(30570437)Objective:ToinvestigatetheoptimalfrequencyandintensityofPulsedMagneticFields(PMF)inrevers-ingmulti-drugresistanceinbreastcancercelllineMCF-7/ADRbothinvitroandinvivo.Methods:MCF-7/ADRcellswereexposedtoPMFofdifferentfrequencies(110Hzand250Hz)andintensities(40mTand10mT)for2hours.Theconcentrationinhibitinggrowthby50%(IC50)wasdeterminedbyMTTsensitivityassay.TheresistanceindexwascalculatedbydividingtheIC50oftheresistantcelllineMCF-7/ADRbythatoftheparentalcelllineMCF-7.ThereversalindexwascalculatedbydividingtheIC50oftheresistantcelllineMCF-7/ADRaftertreatmentwithPMFbythatoftheresistantcelllineMCF-7/ADR.CellstreatedwithPMFanduntreatedcellswereincubatedinrhodamine123(Rh123)solutionfor2hoursat37˚CandtheintracellularaccumulationofRh123wasdetectedbyflowcytometry.Energy-dependenteffluxproteinsthatpumpavarietyofchemotherapeuticagentsfromtumorcellssuchasP-glycoprotein(p-gp)andmultidrugresistance-associat-edprotein(mrp1)onthecellmembranewereevaluatedbyflowimmunofluorescence.Weusedsemiquantita-tivePCR(RT-PCR)todetecttheexpressionofMDR1andMRP1mRNAandtodeterminetheeffectofPMFontheexpressionofmulti-drugresistancegenes.AnMCF-7/ADRcellxenograftmodelwasestablishedinnudemice.ThetumorvolumeandweightweremeasuredtoobservetheeffectofPMFinvivo.Results:PMFeffectivelyreversedtheadriamycinresistanceofMCF-7/ADRcells(P0.01),withamaximumfive-foldeffectusing110Hzand40mT.PMFincreasedtheintracellularaccumulationofRh123by20%andincreasedthequantityofp-gponthecellmembrane.PMFhadlittleeffectonmrp1mRNAbutdecreasedtheexpressionofMDR1andMRP1proteins.PMFcombinedwithADRinhibitedtumorproliferationinourxenograftmodel(P0.01).Conclusion:PMFdecreasesMDR1andMRP1geneexpressionintheMCF-7/ADRbreastcancercelllinebothinvitroandvivo.KeywordsPulsedmagneticfields(PMF);MCF-7/ADR;Multidrugresistance;Nudemice;MDR1;MRP1中国肿瘤临床··1241中国肿瘤临床2008年第35卷第21期研究表明，乳腺癌耐药相关蛋白P-糖蛋白（P-gp）、多药耐药相关蛋白（MRP1）和乳腺癌抗性蛋白（BCRP）的高表达与乳腺癌化疗敏感性有密切关系，也是乳腺癌不良预后的指标［1，2］。本文将探讨脉冲磁场（PMF）对乳腺癌多药耐药性的逆转作用。1材料与方法1.1细胞株乳腺癌敏感细胞株MCF-7和耐阿霉素细胞株MCF-7/ADR均来自中国医学科学院血液病医院研究所。培养基中加入阿霉素（ADR）1.0μg/ml。试验前2周换用无ADR的培养液培养。1.2动物、试剂和仪器BALB/C-nu/nu裸鼠购自中国医学科学院动物中心，为5～6周龄雌性裸小鼠，体重16～19g，饲养于SPF级实验室。RT-PCR试剂盒购自北京博大泰克公司。TrizoleReagent来自invitrogen公司。P-gp-PE和MRP1-FITC标记抗体来自SANTACRUZ公司。脉冲磁场发生仪为本所自行研制开发，其参数值：峰值磁场可调范围：10～40mT，频率可调范围：70～250Hz。1.3MTT法测定耐药性及逆转倍数取对数生长期细胞，0.25%胰蛋白酶消化并调整细胞浓度为2×105/ml，取100μl分别接种于96孔培养板，常规培养24h后按浓度递增加入阿霉素。MCF-7/ADR组经磁场照射2h后继续培养48h，加入MTT40μl（2μg/ml），4h后上酶标仪（492nm波长），测吸光度值（OD），通过曲线拟合求得IC50值，进而求出耐药倍数（耐药倍数＝MCF-7/ADR的IC50值/MCF-7敏感细胞的IC50值）和逆转倍数（逆转倍数＝对照组IC50值/照射组IC50值）。实验重复三次。1.4流式细胞仪定量检测药物蓄积性取对数生长期细胞，经脉冲磁场照射后，消化并调整细胞浓度为1×106/ml，取1ml，加入1μl（1μg/ml）罗丹明123（Rh123），继续培养2h，PBS洗三次，流式细胞仪检测细胞内相对荧光强度（激发波长488nm，发射波长575nm）。1.5流式细胞仪定量检测耐药蛋白表达情况1）取对数生长期细胞，经脉冲磁场照射后，消化并调整细胞浓度为1×107/ml，按照试剂盒说明书标记Pgp-PE抗体。上流式细胞仪进行测量。2）采用同样操作应用MRP1-FITC抗体对膜表面MRP1进行免疫荧光标记测量。1.6MDR1和MRP1基因表达量分析Trizole法提取细胞总RNA。由GIBCO公司合成MDR1、MRP1及内参GAPDH（管家基因）引物。RT-PCR反应参照试剂盒说明书。循环条件：热启动94℃5min，94℃变性50s，58℃退火50s。72℃延伸1min，共循环25次。最后72℃延伸8min结束反应。1.7裸鼠移植瘤实验裸鼠15只，随机平均分成三组：生理盐水组、阿霉素组、阿霉素+PMF组。裸鼠经放射处理（300cGy，4min）［3］后皮下接种肿瘤，每只接种2×107个细胞。当肿瘤长到5mm×5mm时，腹腔注射阿霉素（4mg/kg），110Hz，40mT磁场照射4h。每隔4天称量瘤体积（计算公式：V=∏/6×（（A+B）/2×3），32天后拉颈处死，测量肿瘤重量。2结果2.1MTT实验测定耐药性及逆转倍数由表1可知，经磁场照射后MCF-7/ADR细胞的IC50值明显下降（P0.01）；脉冲磁场能有效逆转MCF-7/ADR的耐药性，其中110Hz，40mT的指标对耐药细胞的逆转效果最好，逆转倍数可达5倍左右。表1MCF-7和MCF-7/ADR细胞对不同脉冲指标的IC50值、耐药倍数及逆转倍数（x±s，n=15）Table1IC50，resistanceindex,andreversingindexofMCF-7andMCF-7/ADRindifferentPMFlevels2.2药物蓄积性统计100-103道数内细胞的相对荧光信号强度，与未经照射组（相对荧光信号强度100%）比较，照射组荧光信号强度明显上升，其中110Hz，40mT组（相对荧光强度81.4%）能提高约20%，提示细胞内Rh123蓄积量下降，推测PMF能逆转MCF-7/ADR的耐药性，所得结果与MTT实验基本吻合。2.3耐药蛋白表达情况统计100-103道数内细胞的相对荧光信号强度，与未经照射组（相对荧光信号强度87.5%）比较，照射组荧光信号强度明显上升，其中110Hz，40mT组（相对荧光强度36.3%）结果最为明显。脉冲磁场对MCF-7/ADR细胞膜表面的MRP1蛋白表达量无显著性影响。2.4MDR1和MRP1基因表达量分析采用Bandscan5.0分析软件对电泳条带进行灰度比值分析，与未经处理的MCF-7/ADR细胞比较，经磁组别MCF-7MCF-7/ADR110Hz,40mT110Hz，10mT250Hz，40mT250Hz，10mT*P0.01与对照组比较IC50值0.73±0.5637.63±1.867.05±0.83*11.41±1.64*23.24±2.11*27.64±2.34*耐药倍数51