提取分离方法

第一节中药化学中的主要化学成分类型糖类，苷类，醌类，苯丙素类，黄酮类，萜类和挥发油，生物碱，甾体化合物，三萜类，鞣质。第二节生物合成一、一次代谢及二次代谢这些是植物生命活动不可缺少的物质，该过程存在于所有的绿色植物中，称为一次代谢过程，产生的物质称为一次代谢产物（primarymetabolites）。1．一次代谢：二氧化碳、水各种代谢糖和氧气糖、蛋白质、脂质、核酸等光合作用这些物质对植物生命活动不起主要作用，该过程不是存在所有的绿色植物中，产生的生物碱、萜类等化合物称为二次代谢产物（secondarymetabolites）。2．二次代谢：一次代谢产物生物碱、萜类、黄酮、蒽醌等特定条件在植物学、生物学、植物化学、生物化学等学科知识的基础上，应用同位素示踪技术从可能的新陈代谢过程、生化反应等多方面推测各类化学成分在植物体内的形成过程，即植物化学成分的生物合成学说。二、生物合成学说三、主要的生物合成途径1.醋酸-丙二酸（AA-MA）途径：脂肪酸类、酚类、蒽醌类2.甲戊二羟酸类（MVA）途径：萜类、甾类3.莽草酸途径（shikimicacidpathway）：苯丙素类、黄酮类4.氨基酸（aminoacidpathway）途径：生物碱5.复合途径：复杂的化合物四、生物合成的意义有利于天然化合物的结构分类或推测有利于植物化学分类学以及仿生合成等学科的发展指导使用组织培养方法进行物质生产第三节提取分离方法一、中草药有效成分的提取提取方法：按提取原理分类：溶剂提取法、水蒸气蒸馏法、超临界流体萃取法，其他方法（升华法，超声提取法，微波提取法）溶剂提取法最为常用。(一）溶剂提取法1．溶剂提取法的原理：依据中药中各种成分的溶解性能，选用对有效成分溶解度大，对杂质溶解度小的溶剂将有效成分从药材内溶解出来的方法。（1）常用溶剂水、亲水性有机溶剂、亲脂性有机溶剂。其极性大小如下：水＞甲醇＞乙醇＞丙酮＞正丁醇乙酸乙酯＞乙醚＞氯仿＞二氯甲烷＞苯＞四氯化碳＞石油醚亲脂性有机溶剂亲水性有机溶剂（2）常见官能团极性比较：羧基＞酚羟基＞醇羟基＞氨基＞酰氨基(巯基)＞醛基＞酮基＞酯基＞醚基＞烯基＞烷基（3）化合物的极性判断：由分子中官能团的种类、数目及排列方式等综合因素决定。分子较小，极性基团多的物质：亲水性较强—易溶于亲水性溶剂分子较大，极性基团少的物质：亲脂性较强—易溶于亲脂性溶剂4）溶解规律：相似相溶是从中药中提取有效成分的重要依据之一。选择溶剂的原则：对有效成分溶解度大，而对共存杂质的溶解度最小。2．溶剂的选择常用溶剂可分为以下三类：①水可以溶解：氨基酸、糖类、无机盐等。②甲醇、乙醇、丙酮（与水任意比例混溶）：苷类、生物碱、鞣质等。特点：水溶性较大对植物细胞穿透能力较强对许多成分的溶解性能好，提取完全毒性低，价格便宜，回收方便。乙醇提取中药化学成分是目前最常用的方法。挥发油、油脂、叶绿素、树脂、内酯、某些生物碱及一些苷元。特点：沸点低，浓缩回收方便，易燃，有毒，价贵，设备要求较高，穿透药材组织的能力较差，有局限性。③亲脂性有机溶剂可溶解：（与水不能任意混溶）3．溶剂提取顺序：（1）系统溶剂提取法按极性递增的顺序石油醚或汽油——油脂、蜡、叶绿素、挥发油、游离甾体及三萜类化合物氯仿或乙酸乙酯——游离的生物碱、有机酸、黄酮、香豆素等苷元甲醇、乙醇、丙酮——苷类、生物碱、鞣质水——氨基酸、糖类、无机盐提取液浓缩成膏，拌硅藻土等辅料，减压干燥成粉再以不同极性溶剂进行分步洗脱。（2）先用乙醇（或含水乙醇或含水丙酮）提取①浸渍法②渗漉法③煎煮法④回流法⑤连续回流法４．溶剂提取的方法：提取溶剂性能特点适宜提取成分提取方法强极性溶剂溶解范围广（酸水、碱水）生物碱盐穿透能力强苷类价廉易得、安全鞣质煎煮法糖类渗漉法水有些脂溶性成分溶解不完全氨基酸浸渍法有些苷类成分的酶解蛋白质水提液易发霉、变质水溶性杂质多，过滤困难沸点高，浓缩困难常用提取溶剂性能特点提取溶剂性能特点适宜提取成分提取方法除去多糖、溶解范围广（不同浓度乙醇）蛋白质外渗滤法（稀醇）水溶性杂质溶出少的大多数浸渍法乙醇可抑制酶的活性化学成分回流法提取液不易发霉、变质均可连续回流法大部分可回收利用但有挥发性、易燃烧甲醇溶解特点与乙醇相似，但有毒丙酮溶解性能同乙醇，但沸点低、易挥发，作为提取溶剂不常用；但对色素溶解性能好，在分离、精制时常用。亲水性有机溶剂（和水可任意混溶）常用提取溶剂性能特点提取溶剂性能特点适宜提取成分提取方法对化合物溶解选择性较强;水溶性杂质少、易纯化;游离生物碱回流法挥发性大、易燃烧、有毒;苷元连续回流法价格昂贵，对提取设备要求高;某些苷类穿透力较弱，提取时间长;作为提取溶剂不常用。如:乙醚bp.35℃，极易燃氯仿bp.61℃、d1.480，不易燃，毒性大，对生物碱溶解性好苯bp.80.1℃，毒性大石油醚沸程30~60℃、60~90℃、90~120℃脱脂、脱色常用与甲醇、乙醇不能任意混溶。亲脂性有机溶剂常用提取溶剂性能特点（二）水蒸气蒸馏法适用于：挥发性成分，随水蒸汽蒸馏，不与水发生反应共水蒸馏：水量不断减少，焦糊现象隔水蒸馏：水蒸汽发生器，不存在焦糊现象（三）二氧化碳超临界流体萃取技术（CO2-SFE）超临界流体萃取技术：以超临界流体作为萃取介质的一种提取新技术。超临界流体：处于临界温度（Tc）、临界压力（Pc）以上，介于气体与液体之间的流体。特点：具有液体和气体的双重特性，如：密度与液体近似黏度与气体近似对很多物质有很强的溶解能力扩散系数是液体的100倍（不及气体）中药提取常用的超临界流体CO2的优点：1.临界温度（Tc=31.4）接近室温,热敏成分稳定。2.临界压力（Pc=7.37MPa）不太高,易操作。3.本身呈惰性，与化合物不反应。4.价格便宜。超临界流体萃取中药成分的主要优点：1.可以在接近室温下工作，防止热敏成分的破坏或逸散。2.萃取过程几乎不用有机溶剂，萃取物中无溶剂残留，对环境无污染。3.提取效率高，节约能耗。二、中药化学成分分离与精制方法分离依据分离方法分离原理或特点二相萃取法分配系数（K）差异逆流分溶法（CCD）液滴逆流色谱法（DCCC）高速逆流色谱法（HSCCC）液-液分配柱色谱正相色谱和反相色谱加压液相色谱法正相色谱和反相色谱快速色谱（2个大气压）低压液相色谱（LPLC）（5个大气压）中压液相色谱（MPLC）（5-20个大气压）高压(效)液相色谱法（HPLC）（大于20个大气压）分配系数（K）差异（1）液液萃取与分配系数K值是利用混合中各成分在两种互不相溶的溶剂中，分配系数不同而达到分离的方法。分配系数：K=CU/CL萃取时，各成分在两相溶剂中分配系数差异越大，则分离效果越好。A、B两种溶质用氯仿与水分离，V氯仿/V水=1，假设KA=10，KB=0.1液-液萃取法（2）A、B两种溶质在同一溶剂系统中分配系数的比值称为分离因子。β=KA/KB（KA＞KB）当β≥100，一次萃取可分离；10≤β＜100，10-12次；β≤2，100次；当β≌1时，则KA≌KB，意味着两者性质极其相近，无法实现分离。（3）分配比与PH的关系对于酸性、碱性化合物及两性化合物来说，分配比还受溶剂系统PH的影响。游离状态一般可溶于有机相，反之不溶。以酸性物质（HA）为例一般pH＜3时，酸性物质多呈非离解状态(HA)，碱性物质多呈离解状态（BH+)存在；但pH＞12时，酸性物质多呈离解状态(A-))，碱性物质多呈非离解状态(B)。因为酚类化合物的pka值一般为9.2-10.8，羧酸类化合物的pka值约为5，故pH3以下大部分酚酸性物质将以非离解形式(HA)存在，易分配于有机溶剂中；而pH12以上时，则将以离解形式(A-)存在，易分配于水中。类型固定相流动相应用正相色谱水BAW系统极性、中极性物质分离（以PC为例）反相色谱ODS甲醇-水、乙腈-水非极性、中极性物质的分离（以ODS为例）常用分配色谱介绍类型压力（Pa）分离规模分析用高压液相色谱（HPLC）20.2×1051mg左右制备用高压液相色谱（HPLC）5mg中压液相色谱(MPLC)5.05×105~20.2×105100mg低压液相色谱(LPLC)5.05×1050mg~1g快速色谱约2.02×10510mg物理吸附（表面吸附）特点:无选择性、吸附可逆、可快速进行，应用较多如:硅胶极性吸附剂氧化铝极性吸附剂吸附性差别活性炭非极性吸附剂化学吸附的特点:有选择性、吸附牢固或不可逆、洗脱难，应用少。如:碱性氧化铝对酚酸类（黄酮、蒽醌）的吸附强酸性硅胶对生物碱的吸附强吸附性差别半化学吸附的特点：吸附力介于上述二者之间，较弱。如:聚酰胺（氢键吸附）大孔吸附树脂吸附原理（范德华引力或产生氢键）分子筛原理（本身多孔性结构的性质决定的）（1）物理吸附基本规律—相似者易于吸附吸附三要素：吸附剂、溶质、溶剂。吸附法分离的依据：化合物极性差异愈大，吸附性差异愈大，分离效果愈好。常用的吸附剂：活性炭、硅胶、氧化铝等。活性炭：是非极性吸附剂，对非极性物质具有较强的亲和力。吸附规律：吸附力大小比较①芳香族化合物＞脂肪族化合物②分子量大的化合物＞分子量小的化合物③在水中对溶质的吸附力＞在有机溶剂中对溶质的吸附力硅胶、氧化铝：为极性吸附剂，对极性物质有较强的吸附力。吸附原理：硅醇基与化合物形成氢键硅醇基与水形成氢键硅胶吸附的水分愈多，吸附其他化合物的能力愈弱。吸水量超过17％，不能作为吸附剂了。加热到100～110℃时即可除去水，恢复吸附活力，这一过程称为硅胶的活化。①对强极性物质的亲和力强于弱极性物质。②溶剂极性弱，吸附剂对溶质吸附力相对强，溶剂极性强，吸附剂对溶质吸附力相对弱。③溶质被硅胶、氧化铝吸附，当加入极性更强的溶剂时，又可被后者置换洗脱下来。其吸附特点是：常用吸附色谱介绍吸附剂分离原理吸附规律应用硅胶吸附原理弱酸性、极性吸附剂广泛（酸、碱及化合物极性越大、中性成分均可）吸附能力强（难洗脱）溶剂极性越小，吸附力越强氧化铝吸附原理碱性、极性吸附剂碱性、中性成分吸附规律同上（酸性成分与铝络合）活性炭吸附原理非极性吸附剂吸附规律与上相反脱色（脂溶性色素）属于氢键吸附，不但适用极性物质也适用于非极性物质的分离。特别适合酚类、醌类、黄酮类、鞣质的分离。性质：为高分子聚合物质，不溶于水、甲醇、乙醇、乙醚、氯仿及丙酮等常用有机溶剂，对碱较稳定，对酸尤其是无机酸稳定性较差，可溶于浓盐酸、冰醋酸及甲酸。（2）半化学吸附-聚酰胺吸附在水溶液中大致有下列规律①形成氢键基团的数目：越多，吸附力越强。溶质对吸附的影响②分子内氢键：被分离物质形成分子内氢键的吸附力减弱。③芳香程度：分子中芳香程度化高者，吸附力强。①溶剂通过改变聚酰胺对溶质的氢键结合能力而影响吸附过程。如聚酰胺与酚类或酮类等化合物形成氢键缔合的能力在水中最强，在含水醇中则随着醇浓度的增高而相应减弱，在高浓度醇或其它有机溶剂中则几乎不缔合。溶剂对吸附的影响故在聚酰胺柱色谱分离时，通常用水装柱，样品也尽可能作成水溶液上柱以利聚酰胺对溶质的充分吸附，随后用不同浓度的含水醇洗脱，并不断提高醇的浓度，逐步增强从柱上洗脱物质的能力。各种溶剂在聚酰胺上的洗脱能力由弱到强的顺序:水甲醇丙酮氢氧化钠水溶液甲酰胺二甲基甲酰胺尿素水溶液甲酰胺、二甲基甲酰胺及尿素水溶液因分子中均有酰胺基，作为第三者可以同时与聚酰胺及酚类等化合物形成氢键缔合，故有很强的洗脱能力。②溶剂也会参加吸附剂表面的争夺而影响吸附过程。③此外，水溶液中加入碱或酸均可破坏聚酰胺与溶质之间的氢键缔合，也有很强的洗脱能力，可用于聚酰胺的精制及再生。常用的聚酰胺再生剂有10％醋酸、3％氨水及5％氢氧化钠水溶液等。聚酰胺的应用①聚酰胺对一般酚类、黄酮类化合物的吸附是可逆的(鞣质例外)，分离效果好，加以吸附容量又大，故聚酰胺色谱特别适合于该类化合物的制备分离。②对生物碱、萜类、甾体、糖类、氨基酸等其他极性与非极性化合物的分离也有着广泛的用途。③因为对鞣质的吸附特强，近乎不可逆，故用于植物粗提取物的脱鞣处理特别适宜。④聚酰胺色谱也有薄层色谱与柱色谱两