16 植物原生质体融合技术

第16章植物原生质体融合技术PlantProtoplastFusion◆What基本原理◆Why技术应用◆How技术方法微丝叶绿体线粒体质膜液泡细胞核内质网微管细胞壁高尔基体植物细胞模式图细胞壁由三种主要成分构成纤维素25-50%、半纤维素53%和果胶5%◆What基本原理◆去除植物细胞壁以获得大量的原生质体◆诱导原生质体融合形成杂种细胞◆筛选，培养，促进杂种细胞分裂，分化◆从细胞团，愈伤组织到最后成株◆Why技术应用植物原生质体融合的意义：◆克服种、属以上植物有性杂交不亲和性障碍◆为携带外源遗传物质的大分子渗入细胞创造条件◆How技术方法第16章植物原生质体融合技术PlantProtoplastFusion•植物原生质体的制备•植物原生质体的培养•植物原生质体的融合一、植物原生质体的制备•原生质体的概念及培养的意义•原生质体材料来源•原生质体的分离•原生质体的纯化1、原生质体的概念及培养的意义•概念：–除去植物细胞壁的裸露细胞，称为原生质体•意义：（1）植物原生质体，具有再生完整植株的力。（2）为细胞融合研究提供了可能。有可能产生异源杂交新品种。（3）由于除去了细胞壁，降低了细胞的DNA酶活性，从而有助于外源DNA的进入。为再生成具有新性状的植物体提供有利条件。（4）是开展遗传理论研究的材料。植物原生质体在理论研究和细胞工程中的地位信息传递、能量转换细胞壁合成机理膜的结构与功能核质关系杂交或自交不亲和的机理细胞间的相互作用植物激素的作用机理融合产生体细胞杂种分离各种细胞器引入各种细胞器导入外源基因诱发突变体纯化后的叶肉原生质体2、原生质体材料来源★植物叶片－取材容易－比较容易用酶解法分离★植物根尖组织－可由各种植物的种子萌发后取得★植物花粉－产生单倍体原生质体★愈伤组织、悬浮培养的细胞－细胞壁容易解离3、原生质体的分离A、原生质体的分离方法★机械分离法－先将细胞放在高渗溶液中预处理，待细胞发生轻微质壁分离，原体质体收缩成球形式，再用机械法磨碎细胞，从伤口处可以释放出完整的原生质体。－优点：该方法可避免酶制剂对原生质体的破坏作用。－缺点：获得完整的原生质体的数量比较少。★酶解分离法–常用的细胞壁降解酶种类：纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、果酸酶等–优点：可以获得大量的原生质体，而且几乎所有的植物或它们的器官组织或细胞均可用酶解法获得原生质体。–缺点：酶制剂中均含有核酸酶、蛋白酶、过氧化物酶以及酚类物质。影响所获原生质体的活力。B、影响原生质体数量和活力的因素1）不同种类植物或不同组织和细胞，其细胞壁的组成和结构有差异2）渗透压稳定剂：如甘露醇、山梨醇、蔗糖、葡萄糖、盐类（KCl,MgSO4.7H2O)等3）质膜稳定剂：如葡聚糖硫酸钾、氯化钙、磷酸二氢钾等增加对质膜的稳定性4）酶液的pH值：一般在5.4-6.05）温度因子6）植物材料的生理状态：如株龄、发育状态、栽培条件等对取材影响很大C、分离原生质体所用的酶液和稳定剂▲烟草叶肉细胞：0.5%MacerozymeR-10果胶酶+2%OnozukaR-10纤维素酶，0.7M甘露醇。▲烟草悬浮细胞：2%Driselase纤维素酶+2%Cellusase纤维素酶+0.5%Macerozyme果胶酶；海水。▲胡萝卜悬浮培养的细胞：2%Onozuka纤维素酶+0.5%Driselase纤维素酶+0.5%Rhoxyme半纤维素酶1%Pectinase果胶酶；0.35M甘露醇+0.35M山梨醇▲甘蓝等的根细胞：4%Maicelase纤维素酶+2%Rhozyme半纤维素酶+0.3%Macerozyme果胶酶；0.7M甘露醇。▲番茄无菌苗的子叶和叶肉细胞：1.5%Cellulysin纤维素酶+0.3%Macerozyme果胶酶；102.6g/L蔗糖。▲水稻种子的愈伤组织的悬浮培养细胞：2%OnozukaRs纤维素酶+1%Driselase纤维素酶+2%MacerozymeR-10果胶酶+1%Pectolyase果胶酶；0.3M葡萄糖4、原生质体的纯化•去除破碎的原生质体、末去壁的细胞、细胞器及其他碎片等杂质A、过滤法B、漂浮法C、离心法例:烟草叶肉细胞原生质体的分离1).材料的准备与消毒：2).酶解：3).纯化：4).原生质体的活力测定1).材料的准备与消毒选取在温室中生长两个月左右的烟草植株从生长健康的植株上摘取充分展开的嫩叶片经自来水冲洗干净后放入70%乙醇中进行表面消毒然后再放入2%次氯酸钠溶液中处理10分钟接着用无菌水洗涤3～4次，以充分除去消毒剂2).酶解用一把尖镊子，小心撕去叶片的下表皮，将叶片切成2cm长的小片，然后放入含酶溶液中处理。（注意：使撕去表皮的一面朝下，温度25～28℃下经3-4小时的酶解反应，其间轻轻摇动培养皿若干次）3).纯化将酶解悬浮液通过300-400目网，以除去大的未消化的碎片然后将含有原生质体的酶液收集在离心管中，低速离心，使原生质体沉于管底，倾去上清液在离心管中加入适量洗涤液，再离心；重复此步骤3次，使酶解液充分除去；最后用原生质体培养液离心一次分离、洗涤、纯化原生质体的试剂试剂分离洗涤纯化KH2PO427.2mgKNO3101mgCaCl2.2H2O1480mgMgSO4.7H2O240mgKI0.16mgCuSO4.5H2O0.025mg甘露醇13%纤维素酶4%果胶酶0.4%蔗糖----21%pH5.65.65.6与分离试剂相同与分离试剂相同4).原生质体的活力测定形态：把形态上完整，富含细胞质，颜色新鲜的原生质体释放到降低渗透压浓度的洗涤液或培养基中，即可见到分离后缩小的原生质体会恢复原态，成为正常膨大的一般是有活力的原生质体。染色法：用0.1%酚藏花红液染色，活的原生质体能着红色用荧光素双醋酸酯（FDA）染色，在荧光显微镜下观察到带有荧光的是有活力的原生质体FDA法的原理FDA本身不具有极性，不能发出荧光，可以自由出入细胞膜。在活细胞中，FDA被酯酶裂解，释放出有极性的荧光素。荧光素不能自由穿越质膜，在活细胞中积累。荧光素在死细胞中不能积累。在UV照射下，活细胞中的荧光素发出绿色荧光。FDA荧光素活细胞死细胞请思考活细胞死细胞FDA先用丙酮配成0.5%的母液，终浓度为0.01%原生质体分离纯化流程图第16章植物原生质体融合技术PlantProtoplastFusion•植物原生质体的制备•植物原生质体的培养•植物原生质体的融合二、植物原生质体的培养1、原生质体的培养方法2、原生质体培养程序3、原生质体培养成功的技术关键•固体培养法–原生质体按照一定细胞起始密度，均匀分布于薄层固体培养基中–此法优点有利于对单个原生质体的胞壁再生和对细胞团形成的全过程进行定点观察•浅层液体培养法：–在培养皿或三角瓶中注入3~4ml原生质体培养液，然后将纯净的原生质体，按一定的细胞密度注入并进行培养•双层培养法–在固体培养基上，加入适宜原生质体胞壁再生和细胞分裂的液体培养基1、原生质体的培养方法2、原生质体的培养程序•细胞壁再生：–体积膨大，叶绿体重新排列，新的细胞壁开始合成，细胞由球形变成椭圆形。•细胞分裂形成细胞团：–一般在培养2-3天后细胞质增加，细胞器增殖，DNA、蛋白质等合成增加，细胞分裂，形成小的细胞团，发育成愈伤组织或胚状体。•器官形成植株再生：–从愈伤组织诱导发生–胚状体发育3、原生质体培养成功的技术关键•原生质体的活力–影响因素：制备原生质体的方法，渗透压稳定剂种类、浓度，质膜稳定剂种类、浓度，温度和保温时间•原生质体密度–起始密度一般为104-105个/mL•细胞壁再生速度–植物种类和取材的生理状态；培养细胞所处的时期；酶解时所用质膜稳定剂种类•原生质体培养的营养和环境–培养基–原生质体培养的环境：光照、温度、湿度第16章植物原生质体融合技术PlantProtoplastFusion•植物原生质体的制备•植物原生质体的培养•植物原生质体的融合回顾：动物细胞融合技术简介◆亲本的来源◆融合方法◆融合细胞的筛选◆融合细胞的克隆◆融合细胞的鉴定三、植物原生质体的融合1、植物细胞融合的概念和意义2、植物细胞融合的程序3、诱导细胞融合的方法及融合剂4、细胞融合的影响因素5、细胞杂种的选择和鉴定1、植物细胞融合的概念和意义•细胞融合(cellfusion)概念：–又称细胞杂交(cellhybridizaion)：离体条件下用人工的方法把不同的细胞通过无性方式融合成一个杂合细胞的技术。•细胞融合的意义：–克服种、属以上植物有性杂交不亲和性障碍–为携带外源遗传物质的大分子渗入细胞创造条件2、植物细胞融合的程序◆原生质体分离的分离、纯化◆融合方法选择◆杂种细胞的筛选◆愈伤组织形成器官分化植株再生◆杂种植物的鉴定3、诱导原生质体融合的方法及融合剂◆盐类融合法◆高Ca2+和高pH值融合◆聚乙二醇（PEG）融合法◆PEG与高Ca2+和高pH值结合融合法◆电融合法回顾：诱导动物细胞融合的方法1、病毒诱导细胞融合2、化学融合剂诱导细胞融合3、电融合法A.盐类融合法•盐类融合剂种类–硝酸盐类：NaNO3、KNO3、Ca(NO3)2–氯化物类：NaCl、CaCl2、MgCl2、BaCl2–葡聚糖硫酸盐类：葡聚糖硫酸钾、葡聚糖硫酸钠•盐类融合的优缺点–优点：盐类融合剂对原生质体的活力破坏力小–缺点：融合频率低，对液泡化发达的原生质体不易诱发融合B.高Ca2+和高pH值融合•Ca2+浓度0.05mol/L•pH9.5-10.5具体做法(以烟草为例)•取分离、纯化好的两种亲本原生质体以1:1的比例混合;•加入0.05mol/LCaCl2.2H2O和0.4mol/L甘露醇;•再用甘氨酸钠缓冲pH值到10.5，成为融合液，同时在37℃下保温0.5h;•用0.4mol/L甘露醇洗净高CaCl2和高pH值；•两种原生质体的融合率达到10%。C.聚乙二醇（PEG）融合法•Polyethyleneglycol(PEG)是一种多聚化合物,分子式H(OHCH2-CH2)nOH,平均相对分子量200-20000之间•融合机制：可能是由于带有大量负电荷的PEG分子和原生质体表面的负电荷间在钙离子的连接下形成静电键，促使异源的原生质体间的粘着结合•用相对分子质量为1540的PEG处理40-50min；再用培养液缓慢稀释PEG最后洗去PEG，得到10%的异核体D.PEG与高Ca2+和高pH值结合融合法•先用PEG处理30min；（PEG是相邻原生质体表面间的分子桥）•然后用高Ca2+和高pH值液，稀释PEG；（引起原生质体表面电荷的紊乱和再分布，从而促进了融合）•再用培养液洗去高Ca2+和高pH值PEG诱导原生质体融合过程E.电融合法•原理：–改变原生质体质膜表面的电荷和氧化还原电位发生改变，使异种原生质体粘合并发生质膜瞬间破裂，进而质膜开始连接，直到闭和成完整的膜形成融合体。•优点：–对原生质体的损害小，融合率高，重复性强；装置精巧、方便简单，可在显微镜下观察或录像融合过程，免去PEG诱导后的洗涤过程，诱导过程可控性强。电融合基本过程1.将制备好的亲本原生质体均匀混合放入融合小室，微电极型只有一个小室，平行电极型有4个小室，两电极间隔3mm，整个装置放在一个培养皿中2.微电极型：用5-12微安的脉冲电流间断刺激1-5毫秒，原生质体在几秒到几十秒钟的时间内会发生暂时性的收缩，两层膜之间形成小孔，连接成桥，形成一个个泡囊，经点连接到面连接，最后形成融合体,整个过程约10-30分3.平行多电极融合装置法：经过1兆赫如150V/cm交流电场发生双向电脉冲，原生质体在电场力的作用下，极化产生偶极子，原生质体紧密排开成串珠状。在适当时间和强度的直流电脉冲(50ms,1.2-2KV/cm)作用下，质膜发生被击穿，进一步形成融合体细胞电融合过程原生质体的融合过程包括3个主要阶段：1)两个或多个原生质体的质膜彼此靠近；2)局部区域质膜紧密粘连，彼此融合；3)融合完成，形成球形的异核体或同核体。4、细胞融合的影响因素•PEG诱导法：–PEG规格、纯度，作用时间•电诱导法：–原生质体密度–交流电压–交变电场