单个核细胞分离

单个核细胞的分离实验目的1．熟悉免疫细胞分离的常用方法。2．掌握外周血单个核细胞分离方法的原理、操作规程。免疫系统免疫器官免疫细胞免疫分子外周血细胞成分淋巴细胞单核细胞粒细胞红细胞和血小板不同细胞密度不同人的红细胞密度为1.093粒细胞密度为1.092单个核细胞（淋巴细胞和单核细胞）的密度为1.075-1.090血小板：1.030~1.035细胞分离基本原理不同细胞密度不同不同细胞表面生物学特性不同不同细胞表面分化抗原不同•人外周血单个核细胞（peripheralbloodmononuclearcell，PBMC）包括淋巴细胞和单核细胞,是免疫学实验中常用的细胞群。【实验原理】人外周血单个核细胞的体积、形态和比重与外周血其他细胞不同。因此利用一种介于1.075～1.090之间而近于等渗的聚蔗糖-泛影葡胺（ficoll-hypaque比重1.077±0.001）混合分离液作密度梯度离心，离心后不同比重的血细胞在分离液中呈梯度分布。从而分离出PBMC。Ficoll分层液•聚蔗糖-泛影葡胺:商品名为Ficoll,其密度为1.077±0.001。主要用于分离外周血中的单个核细胞，是一种单次差速密度梯度离心的分离法。其主要成分:2份浓度为6℅、密度为1.020g/L聚蔗糖(商品名为Ficoll)与1份浓度为34℅、密度为1.200g/L泛影葡胺水溶液混合。用1.077±0.001的分层液可将细胞分离密度梯度离心(Ficoll)离心试剂与器材•1.标本外周静脉血加EDTA-K2抗凝，或1000U/ml肝素抗凝血。•2.淋巴细胞分离液（聚蔗糖-泛影葡胺，比重(1.077±0.001）有商品供应。•3.Hanks液•4.台盼蓝染液•5.器材水平式离心机、显微镜、细胞计数板等。操作方法•1.取静脉血放入抗凝管，摇匀，先作白细胞计数，然后取1.5ml加入等量Hank液，混匀。•2.取1.5mlFicoll分离液置于灭菌离心管内，用毛细吸管将稀释血液3ml沿管壁徐徐加入离心管，使稀释血液重叠于淋巴细胞分离液上（分层液与稀释血液体积比例为1：2），二者之间有一明显的界面。•3.用水平离心机以2000r/min离心20min，离心后管内容物分为四层，上层为血浆（内含血小板），中间层为分离液，底层为红细胞和多形白细胞，在上、中层液体界面处可见到乳白色浑浊的单个核细胞层•4.用毛细吸管轻轻插到白膜层，沿试管壁周缘吸取该层单个核细胞，移入EP管，2000r/min5min离心去血浆，•加1mlHanks混匀，2000r/min离心5min，弃上清液。•5.末次离心后，吸尽上清后，将细胞悬液体积用Hanks还原至1ml，取一滴细胞悬液置血细胞计数板内计数，计算单个核细胞的回收率。×100%单个核细胞回收率=分离后细胞悬液ml×每毫升单个核细胞数全血ml数×全血中每毫升单个核细胞数单个核细胞数／1毫升细胞悬液)＝4个大方格内细胞总数─────────×10×103×2(稀释倍数)46.细胞活力检测•取2滴细胞悬液与1滴台盼蓝染液混匀，加盖玻片，显微镜高倍镜观察。细胞活力百分率=蓝色细胞数/100个单个细胞数结果判断•活细胞不着色，折光强，由于染料可渗入死亡细胞被染成蓝色，体积略膨大。正常情况下，活细胞应在95%以上。实验讨论•1.注意事项①将稀释的血液加分层液上时，一定要细心，动作要轻，使分离液与血液的界面清楚，避免冲散分层液面或与分层液混合影响分离结果。•②分离人和不同种类动物外周单个核血细胞要使用不同比重的分层液，分离人血所用分层液的比重以1.077±0.001为好；小鼠为1.088,而马则为1.090。•③配制单个核细胞悬液所用的培养液要求等渗，有缓冲作用，并对细胞无毒性方法评价•密度梯度离心法是一种分离单个核细胞的常用方法，•用该方法不能除去其中的单核细胞。临床意义•分离所得的单个核细胞可满足许多实验的需要，可用于细胞的分类鉴定，及各种功能，也可用于进一步纯化淋巴细胞，分离单个核细胞技术是进行细胞免疫试验的重要技术之一。