72单克隆抗体制备

合肥十三中王立新2002年１２月３０日，两场筹备了10年的“太空婚礼”首次在神舟四号飞船上举行，植物细胞“新人”—黄花烟草和革新一号烟草叶肉细胞原生质体，动物细胞“新人”是小鼠B淋巴细胞和骨髓瘤细胞，两批新人同时在“产房”—电融合仪内孕育新生命。一段时间后，我国首批”太空娃娃”终于顺利诞生。对照实验结果表明，细胞融合率大大提高。STS“太空婚礼”太空中处于失重状态，不同种细胞（原生质体）更容易亲近为什么在太空，细胞的原生质体融合率会大大上升？神舟放飞强国梦“太空婚礼”科研项目一：“太空婚礼”科研项目二：挑战自我植物体细胞杂交技术动物细胞融合技术(1)(1)(2)(3)(4)(5)植物体细胞杂交过程示意图同核体同核体异核体（杂交细胞）人工诱导还有3个3个以上细胞的融合-------“太空婚礼”植物科研项目计划书项目植物体细胞杂交原理融合前处理促融方法用途细胞膜流动性、细胞全能性酶解法去壁物理法化学法克服远缘杂交障碍获得具优良性状的杂种植株请同学们阅读课本P52动物细胞融合内容问题：1、什么是动物细胞融合？2、它相当于植物体细胞杂交过程的哪一步？3、它们的过程、基本原理、诱导融合方法和意义是否相同？鼠B淋巴细胞鼠骨髓瘤细胞人工诱导1.1动物细胞融合的概念杂交瘤细胞动物细胞融合（细胞杂交）是指（在一定的条件下）两个或多个细胞结合形成一个细胞（该单核细胞称为杂交细胞）的过程。问题：1、它相当于植物体细胞杂交过程的哪一步？2、它们的过程、基本原理、诱导融合方法和意义是否相同？1.2动物细胞融合过程、诱导方法与原理为什么灭活的病毒能作诱导剂？灭活丧失感染性保留促融合活性过程1.2动物细胞融合过程、诱导方法与原理原理：细胞膜的流动性1.3动物细胞融合技术的意义和应用问题：抗体由什么细胞产生？其化学本质是什么？与抗原作用的特点？主要分布在哪里？1、抗体一个天然抗原物质可有多种和多个决定簇。教材中所说的抗原分子刺激淋巴细胞，说的也就是抗原决定簇刺激B淋巴细胞，使其分裂分化出特异性的浆细胞，分泌特异性抗体。2、抗体的传统生产方法从血清中分离抗体该法制备抗体的特点：产量低、纯度低，且抗体的特异性差、灵敏度低。多种浆细胞动物体内多种抗体抗原读下面一段文字资料，找出单克隆抗体的概念发现：在动物发生免疫反应的过程中，体内的B细胞可以产生多达百万种以上的特异性抗体，但是每个B细胞只分泌一种化学性质单一、特异性强的抗体。要想获得大量的单一抗体，必须用单个B细胞进行无性繁殖，即克隆。3、单克隆抗体的概念单:单个细胞克隆:无性繁殖单克隆抗体:单个细胞克隆产生的化学性质单一特异性强的抗体提示1：对B细胞进行细胞培养可行吗？提示2：所学哪种细胞可以无限增殖？问题：如何大量生产单克隆抗体？一个效应B细胞（只分泌一种特异性抗体）杂交瘤细胞动物细胞培养技术4、单克隆抗体的制备方案动物细胞融合技术单克隆抗体既能产生特异性抗体，又能大量繁殖的细胞一个骨髓瘤细胞（能无限增殖）+制备单克隆抗体1975年英国科学家米尔斯坦和柯勒的实验5、单克隆抗体制备过程步骤注射抗原效应B细胞骨髓瘤细胞融合多种杂交细胞选择性培养基筛选1抗原-抗体杂交法克隆化单克隆抗体筛选2（有限稀释）1.注射抗原的目的是什么？注射抗原效应B细胞骨髓瘤细胞融合多种杂交细胞选择性培养基筛选1抗原-抗体杂交法克隆化单克隆抗体筛选2（有限稀释）2.诱导细胞融合的手段有哪些？注射抗原效应B细胞骨髓瘤细胞融合多种杂交细胞选择性培养基筛选1抗原-抗体杂交法克隆化单克隆抗体筛选2（有限稀释）3.若细胞两两融合后，有几种融合情况？注射抗原效应B细胞骨髓瘤细胞融合多种杂交细胞选择性培养基筛选1抗原-抗体杂交法克隆化单克隆抗体筛选2（有限稀释）4.第一次筛选出的杂交瘤细胞为何需进行克隆化培养和专一抗体检测？5.实际操作中如何经过两次筛选获得能产生特异性抗体的杂交瘤细胞？效应B细胞B淋巴细胞注射抗原骨髓瘤细胞融合B-B细胞杂交瘤细胞瘤-瘤细胞选择性培养基筛选1多种杂交瘤细胞符合要求的杂交瘤细胞抗原-抗体杂交法筛选2（有限稀释）幻灯片34克隆化体外培养小鼠腹腔内增殖单克隆抗体克隆单个杂交瘤细胞，可制备抗一种抗原决定簇的特异单克隆抗体。克隆7、单克隆抗体的突出优点：特异性强、灵敏度高、纯度高、产量大、容易大规模生产6、原理：细胞膜的流动性、细胞增殖8、单克隆抗体的应用诊断试剂——最广泛应用准确、高效、简易、快速运载药物(“生物导弹”—单抗导向，药物为弹头)治疗疾病动物细胞融合与单克隆抗体1、动物细胞融合：（1）概念：（2）诱导剂：（3）主要用途：（4）意义：2、单克隆抗体：（1）制备（2）特点（3）应用现在你能主持“太空婚礼”动物科研项目了吗？项目原理融合前处理促融方法用途膜的流动性、细胞增殖物理、化学、生物法单克隆抗体的制备小鼠免疫处理、细胞分散有助于疾病的诊断、治疗、预防下图是单克隆抗体制备流程阶段示意图思考训练：（1）（）技术是单克隆抗体技术的基础。（2）在图中HAT培养上，未有融合的（）和融合的（）都会死亡，只有融合的杂种细胞才能生长。动物细胞培养、动物细胞融合亲本细胞具有同种细胞核的细胞（3）单克隆抗体与常规的血清抗体相比，最主要的优点是：（）特异性强、灵敏度高，可大量制备（4）选出的杂交瘤细胞既具备骨髓瘤细胞的迅速（）特点，又具备淋巴细胞的（）特点，经过选择性培养的杂交瘤细胞，还需进行（）和（），经多次筛选，就可获得足够数量的能分泌所需抗体的细胞。最后将杂交瘤细胞在体外条件下做大规模培养，或小鼠腹腔内增殖，从（）或（）中，就可以提取出大量的单克隆抗体了。大量增殖分泌专一抗体克隆化培养抗体检测细胞培养液小鼠的腹水（5）淋巴细胞是由动物（）中的（）细胞分化、发育而来。（6）杂交瘤细胞从培养基中吸收葡萄糖、氨基酸的方式（）骨髓造血干细胞主动运输课后作业通过报刊、杂志、互联网或其他媒体搜集资料，了解细胞融合技术与单克隆抗体的新进展，就自己感兴趣的领域，自定选题，写一篇综述报告。参考选题：1、1984年诺贝尔生理学或医学奖2、单克隆抗体的种类；3、单克隆抗体与疾病诊断；4、生物导弹；单克隆抗体的制备看书上53页图，讨论：单抗制备过程分哪几步？请用箭头把代表单克隆抗体制备过程步骤图解的字母按正确顺序连接起来。顺序是有限稀释法稀释多次稀释将培养皿孔内的上清液取出，检测抗体。常用的方法有：酶联免疫吸附试验和免疫荧光测定。