荧光偏振法研究脉冲电场对酿酒酵母细胞膜流动性影响

第!卷!第#期!!!!!!!!!!!!光谱学与光谱分析$%&’!!(%’#!))#+@*#@,!,,年#月!!!!!!!!!!!!-)./01%2/%)3456-)./014&754&3282945:413!!,,!荧光偏振法研究脉冲电场对酿酒酵母细胞膜流动性影响张!鹰!曾新安&!温其标!李!琳华南理工大学轻工与食品学院!广东广州!+#,@?,摘!要!以KS^%#!@*二苯基*#!!+I己三烯&为荧光探剂!采用荧光偏振法探讨了脉冲电场%,!+E$,/AI#!,!@@A2&对酿酒酵母细胞膜流动性影响经+E$,/AI#电场处理后!酿酒酵母细胞膜的流动性显著减小!并且随电场强度和处理时间的增加而减小$通过平板计数法和紫外分光光度计法分别检测了脉冲电场对酿酒酵母细胞存活对数及膜通透性影响结果显示!+E$,/AI#虽然只能使少量的酵母致死!却能使酵母细胞膜的通透性显著增加!膜流动性显著降低并且细胞的存活率随电场强度增大而减小!细胞膜的通透性随电场强度增大而增大这表明细胞膜的流动性降低与细胞膜的通透性升高成正相关!与细胞的存活率成负相关由此推测脉冲电场在对酿酒酵母灭菌过程中!细胞膜是其作用的一个关键位点!膜流动性减小!细胞膜通透性增强!是细胞死亡的主要原因关键词!荧光偏振法$脉冲电场$细胞膜流动性中图分类号!l@?!!文献标识码!7!!!文章编号!#,,,*,+;!,,#,#*,#+@*,+!收稿日期!!,,@*,;*!$修订日期!!,,@*#!*!;!基金项目!国家自然科学基金重点项目%!,?@,!,&和广东省自然科学基金%,?,!,,@&资助!作者简介!张!鹰!#;=年生!华南理工大学轻工与食品学院博士研究生!&通讯联系人!.*A48&’‘4b.5W!2/:0’.6:’/5引!言!!细胞膜是细胞生命活动的必需组织!其结构非常复杂!主要是由脂质和蛋白质两类物质组成的复杂超分子动态系统#;=!年由-85W.1和(8/%&2%5提出的液态镶嵌模型认为细胞膜是一种可以流动的嵌有蛋白质的脂类双分子层结构膜流动性作为膜的一种生物物理学特性!与生物体的生命活动密切相关(#)目前物理及化学条件对膜流动性的影响研究越来越受到人们的关注(!*=)脉冲电场灭菌%):&2.6.&./018/B8.&6220.18&8b408%5!简称SNF技术&是在特殊的处理室里对液态食品施加瞬时高强度的脉冲电场!将其中的微生物杀死的一种方法近些年来脉冲电场在对果汁#牛乳等液态食品的非热灭菌研究中表现出其诱人的应用前景(*#!)然而目前对脉冲电场非热灭菌的深层次机理研究及其应用研究相对较少已有文献显示!细胞膜可能是脉冲电场作用的关键位点!但是目前关于脉冲电场处理对微生物致死作用与细胞膜理化特性的改变之间关系的研究还很少!特别是关于SNF对微生物细胞的流动性的影响国内外还未见详细报导本实验用KS^作为荧光探剂!采用荧光偏振法对脉冲电场处理下的酿酒酵母细胞膜的流动性进行了测定并据此初步探讨了脉冲电场对酿酒酵母的致死作用与细胞膜及其流动性之间的关系#!材料与方法%$%!实验材料酿酒酵母X[XX#,菌种!华南理工大学微生物教研室提供$麦芽汁琼脂培养基!麦芽汁培养基为市购$磷酸盐缓冲溶液S_-%=’,&!KS^%F&:/4公司&!先用四氢呋喃配成!j#,IA%a,aI#母液!闭光?i保存!使用时用S_-稀释成!j#,I@A%a,aI#生理盐水%,’;g(4X&&溶液!使用时稀释+倍!,i下电导率为+,,$-,/AI#%$:!实验装置脉冲电场连续处理系统!本研究室自行研制!最高输出电压达?万伏!小孔处理室容积为!’!Aa!小孔直径AA!处理室电场强度,+,E$,/AI#!平行平板式电极!电极材料为铜!绝缘材料为聚四氟乙烯!脉冲驱动电路波形为方波日立F*?+,,荧光偏光光谱仪!德国-8WA4L#+离心机!DY*##,紫外分光光度计%$=!菌液准备从酿酒酵母斜面上挑取三环菌种接种于麦芽汁培养基中!于,i在摇床中培养#C后!?,,,1)A离心#,A85!弃上清液!将酿酒酵母沉淀稀释于+倍的生理盐水中!在,’,;TS4下抽真空#,A85后接受电场处理%$!脉冲电场灭菌后存活对数检测使用平板计数法!取处理前后的酿酒酵母菌样经,’;g(4X&稀释适当的倍数后!取#Aa于培养皿中!倒入麦芽汁琼脂培养基!在,i培养?C后!数其菌落数!每个样平行做次!取其平均结果的对数值%$?!酿酒酵母细胞核内蛋白质和核酸溢出含量的检测核酸与蛋白质在紫外光区的特征吸收峰分别为!@,和!,5A!在此波长范围内的吸光值的强弱与浓度成正比(#)因此将处理前后的菌液置于离心机中以?,,,1)A转速离心#,A85!取上清液用紫外分光光度计在!@,和!,5A下通过测定核酸和蛋白质的吸光值的变化可以确定核酸与蛋白质含量的相对变化测试中以无菌蒸馏水作为参比溶液%$C!荧光探剂标记菌体细胞膜取经脉冲电场处理前后的酿酒酵母样品#,Aa!?,,,1)A离心#,A85!弃上清收集菌体!用?Aa)^=’,的S_-缓冲液洗涤!?,,,1)A离心#,A85!弃上清!加入?Aa的!j#,I@A%a,aI#KS^!,i温浴一定时间后!重复离心分离操作!将收集到的菌体悬浮在?AaS_-溶液中!用荧光偏振光谱仪测定已用KS^标记的酿酒酵母细胞的荧光光谱图!并记录不同温浴时间与荧光强度及荧光各向异性-值的关系%$E!荧光偏振法测定细胞膜的流动性将温浴后的样品置于恒温循环水浴槽中保持样品架恒温激发狭缝与发射狭缝均为+’,5A以非标记的酿酒酵母样品为空白对照荧光偏振%J&和荧光各向异性%-&!细胞的平均微粘度%7&的计算公式如下J(5$$#\5$^5$$%\5$^%#&-(5$$#\5$^5$$%\5$^%!&7(!J,’?@#J%&式中5$$和5$^是激发光为垂直方向的偏振光!而发射光分别为垂直和水平方向的偏振光时测得的荧光强度!\为光栅矫正因子!\(5^$5^^!5^$和5^^是激发光为水平方向的偏振光!而发射光分别为垂直和水平方向的偏振光时测得的荧光强度(#?)!!结!果:$%!不同电场强度对酿酒酵母的存活对数与细胞膜的通透性影响本SNF实验装置的电极距离是固定的!为AA!通过改变输入电压可改变处理室的电场强度图#所示的是,!+E$,/AI#%!@@A2&范围内不同电场强度下酿酒酵母细胞的存活率由图#可以看到!随着电场强度的增大!酿酒酵母的存活对数不断减小!当电场强度为!+E$,/AI#时!酿酒酵母的存活率已接近零由于在一定范围内!吸光值的大小与其含量成正比!因此通过测得吸光值的变化可研究其含量的相对变化图!是在不同电场强度下!从酿酒酵母细胞膜溢出的核酸和蛋白质的含量变化随着处理电场强度的不断增大!不仅能导致细胞的死亡率提高%见图#&!也能使酵母细胞核内溢出的核酸与蛋白质的含量随之增加%见图!&!据此可以推测细胞膜的通透性增大了!有更多的细胞内容物透过细胞膜溢出到胞外介质中!#$%!H8;55.;3-.#*/6(;(0#6;(*6(272//(;(06(-(96;9/(-236;(0#6’!#$:!&’(5*;*6.0./6’(-(*]*#(./,;.6(0*02089-(9*92/;.+6’(6;(*6(25$;7&7:207*62//(;(06(-(96;9/(-236;(0#6’#’S1%0.85$!’(:/&.8/%/86:$:!酿酒酵母荧光光谱的研究!!KS^被认为是用于研究膜脂流动性的一种比较敏感的荧光探剂!因其可以结合在膜脂的非极性烃链区(#+!#@)通过荧光光谱扫描确定出已标记KS^的酿酒酵母的激发和发射峰值分别为+和?!;5A%见图和图?&!荧光强度分别为;?!’#?!和;#!’,++在以下的荧光强度的测定中酿酒酵母的激发波长与发射波长均采用此值:$=!细胞温浴时间与荧光强度的关系根据酿酒酵母的最适宜生长温度!将温浴的温度选择为,i考虑到将酵母细胞,i水浴中不同时间所测得的荧光强度值会有一定变化!因此研究了细胞温浴时间与荧光强度的关系!其变化情况如图+所示,i的水浴环境下在#+@,A85内酵母细胞的荧光强度随温浴时间加长增加显著!在@,A85以后这种增加趋势变得缓慢!逐渐趋于平衡其可=+#第#期!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!光谱学与光谱分析能原因是经过@,A85后!KS^主要结合在细胞膜上考虑到KS^会逐渐渗入到细胞内对活细胞造成的伤害!本实验中的样品检测都采用,i温浴@,A85测定!#$=!I)96*6.03,(96;8+.//-8.;(39(09(-*(-(25$;7&7:207!#$!I+33.03,(96;8+.//-8.;(39(09(-*(-(25$;7&7:207!#$?!I//(96./2//(;(06-*(-0#6+(.06’(/-8.;(39(09(06(0367:$!不同电场强度对细胞膜流动性的影响使用,!+E$,/AI#的电场强度分别处理酿酒酵母细胞!@@A2后!通过荧光偏振法!根据公式%!&获得酵母细胞膜的荧光各向异性值-值如图@细胞膜所处环境中的微粘度由公式%#&和%&计算得出如图=!!由于荧光各向异性-和微粘度7与膜的流动性成反比关系!因此-!7越大!膜的流动性越低!反之越高图@和图=显示!经过电场处理后酿酒酵母细胞的荧光各向异性-和微粘度7显著增大!即细胞膜的流动性变小+E$,/AI#电场强度虽然对酿酒酵母的杀死率不高%图#&!但是已使细胞膜的流动性和通透性发生显著变化!并且随着电场强度增大!细胞膜的荧光各项异性值-和微粘度7随之增大!即随着电场强度的增大!细胞膜的流动性越来越小由!’#节知随着电场强度不断增大!细胞的存活率越小!通透性不断升高!而其膜流动性不断减小由此可以推测!脉冲电场导致细胞膜流动性的减小与导致细胞死亡有一定内在联系!即细胞膜的流动性降低与细胞膜的通透性升高成正相关!与细胞的存活率成负相关!#$C!I//(96./2//(;(06(-(96;9/(-236;(0#6’.06’(/-8.;(39(09(*03.6;.,7./5$;7&7:207!#$E!I//(96./2//(;(06(-(96;9/(-236;(0#6’.06’(539.367./5$;7&7:207:$?!不同处理时间对细胞膜流动性的影响由于相同电场强度下不同处理时间对酿酒酵母细胞的致死程度不一样因此研究了!,E$,/AI#在,!@@A2下酿酒酵母细胞膜流动性的变化图和图;显示随着电场处理时间的增加!细胞膜的各项异性-值和微粘度7也增大!说明了随着电场处理时间的越长!细胞膜的流动性越小!即膜的稳定性在下降由于电场处理时间越长!细胞存活对数越少!由此可知在一定时间范围内!细胞致死率越高!膜流动性越小+#光谱学与光谱分析!!!!!!!!!!!!!!!!!!!第!卷!#$D!I//(96./2//(;(066;(*6+(066+(.06’(539.367./5$;7&7:207!#$F!I//(96./2//(;(066;(*6+(066+(.06’(/-8.;(39(09(*03.6;.,7./5$;7&7:207!讨!论!!一般影响膜流动的因素主要来自细胞膜本身的组分!遗传因子及环境因子等膜中胆固醇含量#脂肪酸链的饱和度#脂肪酸链的链长#卵磷脂-鞘磷酯比例等成分的变化会导致膜流动性的变化其他环境因素如温度#酸碱度#离子强度#辐照等也会影响膜的流动性另外一些药剂如乙醇浓度也会影响细胞膜的流动性(#=)细胞膜流动性发生变化!细胞不一定死亡如-%5等报道经过冷冻降温处理的方式!会使酒类酒球菌%.5%/%//:2%.58&的细胞膜流动性变小!但是其存活率不发生变化但如果用#,g#?g的酒精冲击酒类酒球菌!它的膜流动性也会减小!而且存活率也大大降低(#)在本实验中!观察到了经过脉冲电场的作用后!酿酒酵母细胞膜粘度增大!流动性明显减小!同时细胞的存活对数也是随着电场作用强度的增大逐渐减小的现象酿酒细胞膜在脉冲电场作用下流动性减小的原因可