开题报告完成版

基于RNA-seq技术的玉米CMS-C花药可变剪接和新转录本的研究学生：汪生庆指导教师：曹墨菊教授学科专业：生物化学与分子生物学日期：2012年12月内容文献综述1背景、目的及意义2材料与方法3预期结果4进度安排51文献综述•玉米(ZemaysL)是我国主要的粮、经、饲三元作物，面积和总产均占非常重要的地位，很长时间内供不应求。提高玉米产量任重而道远。•玉米利用杂交优势来制种，如利用不育化育种不仅充分地持续地保持玉米的杂种优势而且还能节约劳动力成本。1.1植物雄性不育植物雄性不育是指植物在有性生殖过程中不能产生正常的花药、花粉或雄配子的遗传现象，而其雌蕊正常可接受外来花粉进行受精结实。Jones(1924)洋葱。1944以后，在玉米、高粱、油菜、水稻、棉花等高等植物中也发现了雄性不育性，经过选育用于杂种一代种子生产。CMS生理生化1.2植物CMS败育机理的研究1.2.1CMS的生理生化研究物质代谢同工酶植物激素能量代谢光合作用膜脂稳定性•基因表达调控是植物发生雄性不育的重要影响因素。•TwellD等利用cDNA差别显示等分子生物学方法，己鉴定出花粉或花药特异基因。•曹家树等用mRNA差别显示技术。•Erickon等限制性内切酶酶切方法分析pol胞质和cam胞质的mtDNA，杂种后代分析。•袁美等利用Northen对波里马细胞质雄性不育三系线粒体RNA检测，发现3个探针atp6、orf224和orf222。•LevingS对玉米、Kadowaki对水稻的cpDNA酶切后电泳未发现不育系与保持系之间存在多态性。1.2.2CMS的分子水平研究1.3高通量测序（RNA-Seq）技术BrianT.WilhelmUgrappaNagalakshmi《nature》《science》2008年6月目前新一代测序技术的代表有Roche/454，Illumina/Solexa，ABI/SOLiD等。Illumina/Solexa高通量测序具有读长短，通量高，覆盖度更高，定量更准确，测序成本低、极高的精确度和极低的检测限。应用到DNA水平的全基因组测序、基因组重测序、宏基因组研究等；RNA水平的转录组测序和小分子RNA测序；表观基因组学的转录因子结合位点测序、DNA甲基化测序等诸多领域。1.4可变剪接可变剪接（Alternativesplicing，AS）是指一个前体mRNA选择不同的剪接方式产生多种mRNA剪接异构体的过程，是基因调节和产生蛋白质多样性一个至关重要的机制。调控可变剪接的因子主要有反式作用因子、顺式RNA调节序列和其它RNA特征（如外显子长度和RNA二级结构等）。可变剪接的研究方法主要有EST/cDNA技术法、基因芯片法以及最近几年随高通量技术兴起的高通量测序法。1.4.1可变剪接类型根据基因组上同一外显子区域(exonregion)所发生的不同可变剪接事件，可变剪接可划分为四种基本类型：5’端可变剪接、3’端可变剪接，盒式可变剪接（又称跳跃式可变剪接）以及内含子保留型可变剪接，如图1-1所示。图1-1可变剪接事件的类型在生物体内，主要存在7种可变剪接类型：A）Exonskipping;B）Intronretention;C)Alternative5'splicesite;D)Alternative3'splicesite;E)Alternativefirstexon;F)Alternativelastexon;G)Mutuallyexclusiveexon.图1-2七种可变剪接示意图1.4.2中心法则与可变剪接图1-3真核生物mRNA的形成图1-4前体mRNA的构成性剪接和可变剪接事件1.4.3前体信使RNA的剪接过程图1-5剪接体的构成及组装过程1.4.4可变剪接的调控机制•剪接调节因子：剪接特征区域、反式剪接调控因子、顺式剪接调控元件、mRNA空间结构、无义介导的mRNA降解。•剪接调节信号：剪接调节因子结合RNA特定序列。影响剪接体识别剪接位点的序列信号通过与剪接因子等调控蛋白相结合对剪接起调控作用。其中：ESEs：通常被SR（Ser-Arg）蛋白家族成员结合。ISSs和ESSs：被核不均一核糖核蛋白（hnRNPs）结合。ISEs不如其他三类元件具有很好的特点。芯片技术：剪接连接点芯片技术和外显子芯片技术寡核苷酸探针固定在玻璃片，每组探针都和特定的外显子或剪接位点对应，原理如图1-11EST就是一组cDNA序列，具有高通量、快速等优点。有利于全基因组可变剪接的研究。原理如图1-10进行高通量测序原始reads。比对到目的基因组后发现可变剪接位点，分析剪接位点序列特征。EST数据基因芯片高通量测序1.4.5前体信使RNA可变剪接的研究方法三大方法1.5新转录本•新转录本（NovelTranscriptUnit，NovelTU）现有的数据库对转录本的注释不够全面，所以将具有基因就够模型的，在基因间区的转录本作为新转录本对待。•特定基因的PCR产物，并对该产物进行生物信息学分析，确定某个基因间区存在新转录本，以及通过蛋白质组学的研究发现新的转录本。但具有一定的局限性。•高通量测序技术测序产生的大规模的reads通过短序列比对软件匹配到基因或者基因组发现新转录本已经成为现实。•目前新转录本的研究仅仅在预测和简单实验验证基础上。但通过高通量测序研究新转录本已经成为一种趋势。2课题研究的目的及意义•基于玉米C48-2和N48-2Illumina/Solexa测序纯化后的clearreads比对到B73发现C48-2和N48-2中存在上万个基因发生了可变剪接，存在上万个新转录本。2.1课题研究目的及意义1）高通量测序技术数据基础分析可变剪接调控机制和序列结构特征，优化调控模型，预测潜在的可变剪接现象2）研究可变剪接事件产生蛋白质多样性和细胞质雄性不育之间的关系。3）研究新转录本所编码的功能蛋白和细胞质雄性不育之间的关系。3材料与方法3.2.1Illumina/Solexa技术测序流程3.1材料不育系：C48-2保持系：N48-2参考基因组：B733.2方法C48-2和N48-2花药转录组测序，平台2GIllumina/Solexa/Hiseq20003.2.2CleanReads数据的获得及信息分析某些原始序列带有adaptor序列，或含有少量低质量序列。首先经过一系列数据处理以去除杂质数据，得到Cleanreads。1.去除含adaptor的reads2.去除N的比例大于10%的reads3.去除低质量reads（质量值Q≤5的碱基数占整个read的50％以上）4.获得Cleanreads基因表达注释、可变剪接、预测新转录本以及潜在新基因等信息分析（图3-2）。测序评估表达量SOAPaligner/soap2clean-reads比对到B73基因组和基因序列统计比例，获得对总体比对情况的认识。AudicS。Mortazavi的RPKM法计算差异表达比对统计3.3可变剪接分析3.3.1可变剪接算法软件“TopHat”鉴定转录本的剪接位点（junctionsite）。然后，通过分析同一基因的所有剪接位点，找出各种可变剪接事件。分析算法如下：A)ExonSkippingB)IntronRetentionC)Alternative5'SpliceSiteD)Alternative3'SpliceSite3.3.2可变剪接序列特征与机制分析•根据以上可变剪接算法识别的剪接位点，从MaizeGDP下载玉米B73全基因组及基因序列。提取基因剪接位点区域序列，用于可变剪接机制的分析。序列提取按照剪接方式有所不同。提取方法ExonSkippingA3'SpliceSiteIntronRetention5'SpliceSite3.3.3可变剪接事件分析•分别统计不育系C48-2和保持系N48-2中发生了ExonSkipping、IntronRetention、Alternative5'SpliceSite和Alternative3'SpliceSite四种可变剪接事件的可变剪接数量及所涉及基因个数；•C48-2和N48-2中特异发生可变剪接数量及所涉及基因个数，剪接方式及剪接位点；•C48-2和N48-2中共同发生可变剪接数量及所涉及基因个数，剪接方式及剪接位点；•C48-2和N48-2中可变剪接次数与基因长度之间的关系。3.3.4雄性不育相关可变剪接分析选取差异表达（见3.2.4.3）的且在C48-2中特异发生可变剪接以及C48-2和N48-2中发生了可变剪接但剪接位点不一致的基因，根据剪接后产生的转录本序列做一下分析：Blast2GO软件GO功能注释和显著性富集分析。COG数据库进行蛋白相邻类的聚簇蛋白质功能分类分析。KEGGPATHWAY数据库进行代谢通路分析。3.4新转录本分析潜在基因模型（genemodel）中挑选出长度大于150bp，位于基因间区域（一个基因3'端下游200bp到下一个基因5'端上游200bp之间的区域）的潜在基因模型作为候选的新转录本。从MaizeGDP数据库下载B73全基因组和基因序列，提取满足条件的NU外显子起始和终止位点的序列，组装成转录本。用Augustus软件来预测可能的编码蛋白新转录本。并做KO和GO分析，预测潜在的新基因。选取在C48-2中特异表达的新转录本结合预测的功能用于分析新转录本和雄性不育之间的关系。3.5RT-PCR验证新转录本和可变剪接将C48-2，N48-2和B73统一播种与温江农场，在抽穗期前后镜检，判断小孢子发育的时期。收集处于花粉母细胞、四分体、单核期、双核期的花药，用Trizol提取花药总RNA。以提取检测合格的RNA作为模板，采用TakaRaChina按照其操作说明进行cDNA第一链的合成。利用制备的cDNA进行RT-PCR扩增，以验证可变剪接的分析结果。3.6qRT-PCR验证可变剪接事件将cDNA样品稀释10倍后用作qRT-PCR扩增的模版，反应体系如下表，并设立以ddH2O为模板的阴性对照。qRT-PCR反应程序为：98℃预变性2s，60℃退火10s，并在此温度收集荧光，读板（Plateread）的程序进行44个循环。之后从65℃开始，以每步0.5℃的温度梯度升高至95℃，每步温度保持1s，绘制溶解曲线。用Pfaffl法计算样品的相对表达量3.6.1qRT-PCR反应3.6.2qRT-PCR数据分析4预期结果对高通量测序可变剪接序列位点的分析，期望发现新剪接结合序列特征和剪接因子。对C48-2中特异发生可变剪接所产生多样的mRNA转录本编码蛋白功能的分析，期望发现可变剪接转录本和CMS有关系。对C48-2和N48-2中发现的新转录本功能预测以及KO和GO分析，期望发现和CMS相关的新转录本，并发现新基因。5进度安排