HITS-CLIP步骤

第一天：1．细胞培养在100或150mm的平板上，用PBS漂洗，然后placeinStratalinkerwiththecoveroff。以400mJ/cm2照射一次和additional200mJ/cm2inStratalinker。2．收集细胞悬液，4℃下2500rpm离心细胞团5min，3(~3xdryvolume)倍细胞沉淀体积的PBS重悬细胞团，每个eppie加入1ml的细胞悬液，在4℃下快速离心，去上清，然后保存在-80℃备用（每管大约200µl细胞）。备注：1×HBSS：50ml10×Hank’s平衡盐溶液，Ca-Mg-free(Gibco,#14186-012)5ml1MHEPES,pH7.3445mlddH2O第二天：II．免疫沉淀a．溶液（现用现配）1×PXL（washbuffer）1×PBS（组织培养等级tissueculturegrade；不含Mg2+，Ca2+）0.1%SDS0.5%脱氧胆酸盐0.5%NP-405×PXL（高盐washbuffer）5×PBS（组织培养等级；不含Mg2+，Ca2+）0.1%SDS0.5%脱氧胆酸盐0.5%NP-401×PNK缓冲液50mMTris-ClpH7.410mMMgCl20.5%NP-401XPNK+EGTABuffer50mMTris-ClpH7.420mMEGTA0.5%NP-40b．Bead的制备：每一Eppie的交联裂解液使用400µl的蛋白A免疫磁珠(Dynal,100.02)用pH8.0的0.1M的磷酸钠溶液洗小珠三次。（这里使用高pH是因为能增加蛋白A对抗体的结合。然而这需要所有免疫沉淀的缓冲液应该适用于你所用的抗体。例如，我们发现有些抗体在缓冲液中不与脱氧胆酸盐作用。）用350µl的pH8.0的0.1M磷酸钠重悬小珠，加入50µl桥联Ab（2.4mg/ml；兔抗鼠IgG）。在室温旋转试管45min；用pH8.0的0.1M磷酸钠洗三次。在400µlpH8.1的0.1M磷酸钠溶液中重悬小珠，加入3µl的2A8或12µl的7G1-1*ascite液体（5mg/ml）。4°C下旋转试管4小时，1×PXL洗三次；如果你不准备加入交联裂解液，在最后一步移去小珠leavebeadsinlastwashstep。c．RL3(-P)接头（不含P磷）对5’末端的标记。（在做IP之前或过程中制备5’末端标记的接头。用预标记的3’接头做AGOHITS-CLIP，发现在放射自显影图中比免疫沉淀后PNK反应标记分离得到的RNA有更多特异性信号。）2.4µlRL3(-P)接头(50pmol/µl；5’端不含磷酸)5µl10×PNKBuffer(NEB)25µl32P-γ-ATP8µlT4PNKenzyme(NEB,M0201L)3µlRNA酶(Promega)6.6µlwater50µltotal37°C时用ThermomixerR(Eppendorf)孵育30min。加入0.2µl的10mM的ATP，继续反应5min。旋转使树脂重悬在G-25柱子中。事先以735g离心柱子1min，使样品混入树脂，735g旋转柱子2min。如果不打算立即使用，可以置于-20°C保存。d．RNA的部分消化以及超速离心用700µl1×PXL（含蛋白酶抑制剂；总体积为1ml）重悬每管的交联裂解液；加入15µl的RNA酶(Promega)，置于冰上10min。每管加入30µl的RQ1DNA酶，37°C孵育5min1000rpm。在1×PXL中以1:100稀释RNA酶（高浓度RNA酶）在1×PXL中以1:1000稀释RNA酶（低浓度RNA酶）往两只试管中分别加入两种浓度的RNA酶10µl；37°C孵育5min。30Kfor20minat4°C超速微量离心(polycarbonatetubesinTLA120.2rotor)裂解液。小心去上清，留下10µl做immunoblot实验。e．免疫沉淀把剩余的上清加入另一只新的含有bead的试管中。4°C旋转beads/裂解液混合物2-4小时。去上清，留下10µl做immunoblot实验（以确定抗原被除尽）。用冰的缓冲液洗beads：2x1XPXL(WashBuffer)2x5XPXL(High-saltWashBuffer)2x1XPNKBuffer【首次做CLIP实验对象应该是特殊的蛋白，可以跳过III-IV步,直接进行第V步。继续实验直到膜暴露在X-射线胶片上，检查以下问题是否存在：1.在高RNA酶的实验中，蛋白的MW上是否有7kDa的放射性条带？2.对照实验的条带是否不存在？对照组没有UV交联，含不相关的抗体，组织敲除，RNAi，或者没有转染标记的结构。3.在低RNA酶实验中，这条带是否向上移动并且更加扩散？如果是，对RNA结合蛋白进行处理，可以在接下来的实验中继续步骤III。】【对含有低RNA酶（1:300,000）的样品继续步骤III。过渡消化的样品需要跳过III-IV步,保存在4°C直到步骤V。】III．CIP处理（on-bead）8µl10×去磷酸化脱磷酸缓冲液(Roche,712023)3µl碱性磷酸酶(Roche,712023)2µlRNA酶(Promega)67µl水80µl总体积37°C在ThermomixerR(Eppendorf)中孵育20min（每两分钟1000rpm离心15s）。1XPNKBuffer洗一次1XPNK+EGTABuffer洗一次1XPNKBuffer洗两次IV．RNA3’接头的连接（on-bead）8µl10XT4RNAligasebuffer(Fermentas)8µlBSA(0.2µg/µl)8µlATP(10mM)2µlT4RNAligase(Fermentas)2µlRNA酶(Promega)5µlLabeledhotRL3(12pmol,PreparedinIIc)47µlwater80µltotal把80µl连接酶混合液加入含beads试管中。16°C在ThermomixerR(Eppendorf)中孵育1小时（每两分钟1000rpm离心15s）加入4µl的RL3（20pmol/µl；5’末端有磷酸盐），反应过夜。第三天1XPXLbuffer洗一次5XPXLbuffer洗一次1XPNKbuffer洗三次V.PNK处理(On-Bead)8µl10XPNKBuffer(NEB)1µlcoldATP(10mM)4µlT4PNKenzyme(NEB,M0201L)2µlRNA酶(Promega)65µlwater80µltotal每份样品加入80µl的PNK混合液，37°C在ThermomixerR(Eppendorf)中孵育20min（每4分钟1000rpm离心15s）1XPXLbuffer洗一次5XPXLbuffer洗一次1XPNKbuffer洗三次VI.SDS-PAGE以及硝酸纤维素转膜【westernblotforinputandpost-IP；loadequalvolumes.】30µl1XPNK+和30µlNovex加样缓冲液（loadingbuffer）（不含还原剂）重悬beads。在10孔的NovexNuPAGE10%Bis-Tris凝胶中每管液体加入到两个孔洞内，在冷室内，175V跑胶。跑胶完成后，使用Novexwettransferapparatus将其转移至S&SBA-85硝酸纤维素膜上。在30V，用添加了10%的甲醇的NuPAGETransferBuffer转移1个小时。转膜完成后，用1XPBS冲洗硝酸纤维素膜，然后轻轻的印在Kimwipes上；用塑料膜包裹膜，暴露，放射自显影。第四天【因为Ago的存在，如果来自p13脑组织一半的neocortex作为起始原材料，我们能在暴露两个小时后的放射自显影图观察到一个信号。如果仅仅用到很少的材料，看到一个较弱的信号有时需要过夜暴露。】不要从过度消化的样品中克隆RNA，但是可以用它确定接下来的步骤中的RNA-蛋白质复合体的特异性：1．观察过渡消化的样品，在可能出现的蛋白（100kDa）的MW的上部是否存在7kDa的条带。2．计算最近的污染条带的距离，以此确定相关的信号强度所对应的蛋白条带。3．如果你的蛋白条带相比其他的蛋白条带移动的距离超过10kDa，你应该确定纯化的RNA相对你的蛋白的特异性。被低浓度RNA酶消化的RNA-蛋白质复合体会表现出扩散的放射现象，跑胶时会出现在你的蛋白的MW的上部15-20kDa处。【因为Ago的存在，我们会观察到两种不同的模式。一种是Ago-miRNA复合体的110kDa，另一种是Ago-mRNA复合体的130kDa。】4．长度为50个核苷酸的RNA的平均MW为16kDa。标签含有20个核苷酸的街头（L3），能够产生长于50个核苷酸的CLIP标签的蛋白质-RNA复合体的位置在蛋白的MW的上部20kDa处。5．因为RNA的消化是随机的，标签的大小为50-150个核苷酸不等，复合体的移动要比低浓度的RNA酶复合体更加分散（标签大小为20-60个核苷酸不等）。6．为了分离到不同蛋白特异的CLIP标签，需要把条带切得越细越好（3kDa宽的条带），大约在你的蛋白的MW的上部20kDa处。7．另外，切出两条在此条带上部和下部的条带，相距15kDa。下部的条带不含有你的蛋白特异的长于15个核苷酸的任意RNA（但是要表明RNA能够结合任何小分子蛋白）。用干净的手术刀片切除细的条带（4-8kDa），把硝酸纤维素膜切片分别装入微试管中。切片越小越好。用闪烁记数器计算放射性。VII．RNA的分离和纯化1XPKBuffer:100mMTris-ClpH7.550mMNaCl10mMEDTA1XPKBuffer/7M尿素(需要新鲜的):100mMTris-ClpH7.550mMNaCl10mMEDTA7M尿素用1XPKBuffer配制4mg/ml的蛋白酶K溶液；37°C预孵育20min以除去所有可能存在的RNA酶。往每管分离的硝酸纤维素膜中加入200µl蛋白酶K溶液；37°C预孵育20minat1000rpm。加入200µl1xPK/7M尿素溶液；37°C继续孵育20minat1000rpm。加入400µlRNAphenol和130µlCHCl3到溶液中；37°C孵育20minat1000rpm。【可以用0.15MNaOAcpH5.2平衡纯净的苯酚来配制RNA苯酚；氯仿：异戊醇=49:1配制CHCl3】微量离心机最大速度离心试管；取水相，加入50µl3MNaOAcpH5.2，0.75µl的糖原和1mlEtOH：异丙醇=1:1。沉淀在-20°C过夜。第五天IX．RNA5’接头的连接微量离心机最大速度离心RNA10min。观察是否得到少量（decent）沉淀。冲洗并干燥沉淀。用闪烁记数器计算RNA。用5.9µlH2O重悬。RNAligation:1µl10XT4RNAligasebuffer(Fermentas)1µlBSA(0.2µg/µl)1µlATP(10mM)0.1µlT4RNAligase(3U,Fermentas)1µlRL5orRL5DRNAlinker@20pmol/µl4.1µl加入5.9µl用H2O重悬的RNA。10µltotal16°C孵育1-5小时或过夜。往反应体系中加入：79µlH2O11µl10XDNA酶IBuffer5µlRNA酶5µlRQ1DNA酶37°C孵育20min。加入300µlH2O300µl“RNA苯酚”100µlCHCl3离心，取水相。加入：50µl3MNaOAcpH5.20.5µl糖原(Ambion,9510)1ml乙醇:异丙醇=1:1使其产生沉淀。沉淀置于-20°C过夜或1小时第六天X．RT-PCR离心RNA。冲洗并干燥沉淀。如果得到少量（decent）的沉淀，用闪烁记数器计算RNA。8µlH2O重悬沉淀。RT反应体系：混合8µl的连接RNA和2µl的DP3（5pmol/µl，终浓度为1pmol/µl）以及3µl3mMdNTPs。65°C加热5min，冷却并快速离心。加入：1µ