PCR技术详细步骤.

PCR技术详细步骤－从RNA抽提到电泳鉴定RNA抽提一，准备工作1，实验器具与材料：（1）移液枪：1ml、200ul、10ul（2）吸头：1ml、200ul、20ul（3）吸头台：放置1ml吸头的一个，放置200ul和20ul的吸头一个（4）EP管1.5ml、100ul（5）玻璃研磨器（6）容量瓶：1000ml（7）盐水瓶：100ml（8）15ml塑料管一个（配75％乙醇用）2，实验器具的处理与准备（1）塑料制品：（包括吸头、EP管等）将塑料制品逐个浸泡于1‰DEPC水中（必要时小枪头需要用吸管打入DEPC水）37℃过夜，然后送至高压3次，后在80℃烘烤箱中烘干（或置于37℃中8小时左右烘干），试验前将枪头放入吸头台。（2）玻璃制品：（主要是玻璃研磨器）先泡酸过夜，冲洗干净后，在1‰DEPC水中泡8小时左右，37℃烘干，用蒙锡纸包裹送至干烤3次。（3）金属制品：（镊子等）先洗干净，再送干烤3次。（不需要泡DEPC水）3，试剂配制和准备：（1）DEPC水：泡实验器具的DEPC水的配制：1000ml双蒸水中加1mlDEPC，放在1000ml容量瓶中静置4小时后备用。配75％乙醇的DEPC水的配制：100ml盐水瓶内装40ml双蒸水，加40ulDEPC，37℃过夜，送至高压。（2）75％乙醇（要在抽提时现配）：用无水乙醇和DEPC水配制（DEPC水:无水乙醇＝1:3），然后放于-20℃备用。（3）异丙醇：放入棕色瓶（4）氯仿：放入棕色瓶（5）Trizol：100ml/瓶存放于4℃二，抽提时注意事项：全程佩戴一次性手套和口罩，手套要勤换，避免戴上的一次性的手套接触可疑污染物。三，抽提步骤1．匀浆化作用取约100mg鼠脑组织放于玻璃研磨器内，先加0.2ml的Trizol溶液，研磨组织后，倒入1.5mlEP管中，再在研磨器内加入0.8ml的Trizol溶液洗，后全部再倒入EP管中。颠倒混匀10下，室温静置5分钟。2．分离阶段每1mlTrizol中加0.2ml氯仿。盖紧样品管盖，漩涡震荡15秒，使其充分混匀，冰上静置5分钟。后12000rmp离心15分钟。3．RNA的沉淀将上层水相转入新的1.5mlEP管中（约400-500ul），加入0.5ml异丙醇，混匀后放于-20℃中1小时，后12000rmp离心10分钟。34．RNA的洗脱小心倒掉上清，留取沉淀。加1ml现配的75%的乙醇（预冷）振荡洗涤RNA沉淀一次，后7500rmp离心5分钟。5．RNA的再溶解小心倒掉上清，取沉淀置超净工作台开风机吹干（约30分钟，此时RNA沉淀变透明）。注意不能让RNA沉淀完全干燥（会极大地降低它地可溶性）。再在管中加20ul的DEPC水溶解，在55-60℃下孵育10分钟助溶。6，RNA的保存提取的RNA保存于-70℃超低温冰箱中，或立即用于逆转录。TRIzol法抽提总RNA细胞1×107组织100mg↓加1mlTRIzol细胞用1ml加样器吹至液体澄清且无细胞团块↓匀浆（要彻底，后转至EP管）（组织匀浆量100mg时分装1ml/每EP管）↓颠倒混匀10下，室温5分钟↓加氯仿1/5体积（0.2ml）（必须按总体积的1/5）↓颠倒混匀15S，室温5分钟↓4℃，离心12000rmp，15分钟↓转上层水相（约400-500μl）于另一新1.5mlEP管中↓加等体积异丙醇（约400-500μl），混匀后-20℃中1小时↓4℃，离心12000rmp，10分钟↓弃上清↓加冰预冷的75%乙醇（用高压后的DEPC水配）1ml↓4℃离心7500rmp，5分钟↓弃上清，超净工作台开风机干燥约30分钟（不能完全干燥）↓溶于DEPC水中至20μl（10μl-20μl）（可在55-60℃水中，10分钟助溶）↓立即保存于-70℃超低温冰箱中，或立即用于逆转录4逆转录（RT）一，准备工作1，实验器具与材料：（1）移液枪：200ul、10ul（2）吸头：200ul、20ul（3）EP管1.5ml、100ul（4）水浴箱2，实验器具的处理与准备塑料制品：（包括吸头、EP管等）将塑料制品逐个浸泡于1‰DEPC水中（必要时小枪头需要用吸管打入DEPC水）37℃过夜，然后送至高压3次，后在80℃烘烤箱中烘干（或置于37℃中8小时左右烘干），试验前将枪头放入吸头台。3，试剂配制和准备：（1）DEPC水：泡实验器具的DEPC水的配制：1000ml双蒸水中加1mlDEPC，放在1000ml容量瓶中静置4小时后备用。逆转录中所用的DEPC水的配制：100ml盐水瓶内装40ml双蒸水，加40ulDEPC，37℃过夜，送至高压，后分装到几个1.5mlEP管中，-20℃中保存备用。（2）RT中所需要的各种试剂（3）引物浓度计算方法：（新合成的引物的稀释）假如终浓度为XuM(pmol/ul)加DEPC水体积（ul）＝（OD×33×1000000）/（分子量×X）二，RT时注意事项：为避免RNA酶污染，在RT中仍要佩戴一次性手套和口罩。三，RT步骤用SSⅢ逆转录酶进行RT（20ul体积）1，准备0.65ml的EP管2，冰上操作：在EP管中加入10ulDEPC水，1ul引物，1ul模板RNA，1uldNTP，短暂离心。3，65℃水浴5分钟后，立刻0℃冰水浴至少1分钟。4，短暂离心后，冰上操作：加入4ul5×First-StrandBuffer，1ul0.1MDTT，1ulRNAseInhibitor，1ulSSⅢ逆转录酶。5，短暂离心6，50℃水浴60分钟进行逆转录。7，70℃水浴15分钟灭活逆转录酶8，-20℃保存，或立即进行PCR。用AMV逆转录酶进行RT（10ul体积）1，准备0.65mlEP管2，加入4.5ulDEPC水，1ul引物，1ul模板RNA3，稍离心，100℃沸水裕1min4，加入0.5uldNTP，2ul5×Buffer，1ulAMV逆转录酶5，稍离心，封口膜封口，42℃水浴90℃作RT6，100℃沸水裕3min灭活AMV7，立即PCR或-20℃保存。5聚合酶链式反应（PCR）二，准备工作8，实验器具与材料：（1）移液枪：200ul、10ul（2）吸头：200ul、20ul（3）吸头台：放置200ul和20ul的吸头一个（4）EP管1.5ml、100ul2，实验器具的处理与准备(1)塑料制品：（包括吸头、EP管等）送至高压3次，试验前将枪头放入吸头台。3,试剂配制和准备：(1)双蒸水：100ml盐水瓶内装40ml蒸馏水，送至高压，后分装到几个1.5mlEP管中，-20℃中保存备用。(2)PCR中所需要的各种试剂三，PCR时注意事项：佩戴一次性手套，同时避免戴上的一次性的手套接触可疑污染物。四，PCR步骤1，准备100ulEP管2，依次在管中加入：（50ul反应体系）ddH2O37.5ul×？10mMdNTP1ul×？10×PCRbuffer5ul×？25mMMgcl2（加之前要摇匀）3ul×？上游引物1ul×？下游引物1ul×？模板cDNA1ul3，稍离心4，100℃沸水浴1分钟5，趁热加入Tag酶0.5ul（冰上操作）6，再加入50ul液体石蜡封闭7，10000rmp离心1分钟8，PCR条件94℃1min58℃50sec72℃1min30sec进行40个循环，然后72℃10min完后4℃保温。9，10000rmp离心5min10，将下层水相转入新的0.65mlEP管中，-20℃保存。6电泳鉴定一，准备工作1，实验器具与材料：（1）移液枪：10ul（2）吸头：20ul（3）吸头台：放置200ul和20ul的吸头一个（4）三角烧瓶：50ml一个（5）琼脂糖2，实验器具的处理与准备(1)塑料制品：（包括吸头等）送至高压3次，试验前将枪头放入吸头台。（2）电泳板及电泳槽：用自来水冲洗干净备用3,试剂配制和准备：(1)电泳缓冲液（TAE）：先配制0.5mol/L,PH8.0的EDTA溶液：将37.2gEDTA-Na加入160ml蒸馏水中，在搅拌器上剧烈搅拌。在用NaOH调节溶液PH值至8.0（约需4gNaOH）。用蒸馏水定容至200ml。后送至高压灭菌。室温保存。再配制50×TAE溶液：在400ml蒸馏水中溶解121gTris碱，加入28.55ml冰乙酸和50ml0.5ml/LEDTA溶液，再加蒸馏水定容至500ml，室温保存。（2）琼脂糖溶液（1.0％）：50×TAE溶液取10ml，稀释成500ml，取50ml溶解0.5g琼脂糖，电炉上煮至沸腾，溶化的琼脂物冷却至60℃左右时加入10mg/mlEB5ul，充分混匀，将温热的凝胶倒入已置好梳子的电泳板中，在室温下放置45min左右后进行电泳。（3）溴化乙锭（EB）（10mg/ml）：在20ml水中加入0.2g溴化乙锭，磁力搅拌数小时。然后用铝箔包裹容器或将溶液转移至棕色瓶中，室温保存。（4）加样缓冲液（LoadingBuffer）一般为6×LoadingBuffer二，电泳鉴定时注意事项：佩戴一次性手套，避免皮肤接触EB。无路做胶还是电泳缓冲液尽量用新的，不要超过两周。五，电泳步骤1，50×TAE取10ml稀释成500ml，取50ml溶解0.5g琼脂糖。电炉上煮沸后加入EB5ul。另外450mlTAE倒入电泳槽中。9，用透明胶封闭电泳板，琼脂糖溶液冷却至温热时，倒入带梳子的电泳板中，冷却后，拔出梳子，放入电泳槽中。10，加样：PCRMarker：1ulMarker＋1ulLoadingBuffer＋4ulTAE混匀于塑料膜上，加入孔中。PCR样品：5ul样品DNA＋1ulLoadingBuffer混匀后依次加入孔中。11，接上电源，电压120V，电流50mA进行电泳。12，电泳约1小时后，紫外灯检测。