抗体的表达原理

第七章抗体的表达华南农业大学食品学院廖振林提要•基因工程抗体巴在多种体系获得成功表达，包括哺乳动物细胞、大肠杆茵、酵母细胞、昆虫细胞、转基因植物以及转基出动物等表达体系。其中哺乳动物细胞最接近抗体产生的天然宿主，是比较成熟、应用最多的表达体系，主要用于表达完整抗体分子，目前治疗性单抗的生产基本都用这一表达体系。通过对友达载体、宿主细胞及各环节的改良和完善，己可达到100mg／L左右的表达水平，大肠杆菌体系不能对表达产物进行糖基化，只能表达抗体分子片段，但由于其遗传背景清楚，操作简单，成本低，周期短等优点，亦有较广泛的应用，尤其在研究领域。•酵母细胞和昆虫细胞表达体系具有一定的糖基化功能，能表达完整抗体分子，可达到较高表达量，其操作及成本较哺乳动物细脑有一定优势，但在抗体表达中的应用尚不多，应用价值有待评价。转基因植物和转基因动物表达体系主要用于工程抗体的大规模生产，其成功应用尚需时日。抗体载体体统的种类•1哺乳动物表达载体系统•2大肠杆菌表达系统•3酵母及昆虫细胞表达系统•4动植物表达系统第一节哺乳动物细胞表达系统•哺乳动物细胞是最早用来表达抗体分子的，也是目前应用最多的表达体系。哺乳动物细胞内有抗体折叠形成正确立体空间构象所必需的分子伴侣，其内质网为抗体分子的正确折叠和链内及链间二硫键的形成提供了有利的氧化-还原环境。•此外哺乳类动物细胞还拥有完整的转录、翻译后加工及分泌等机制，包括抗体的糖基化、羧基化等一系列复杂的加工过程，因而哺乳动物细胞表达系统表达的抗体通常具有正确的折叠和空间构象以及正确的装配，具有良好生物活性，基本近似于天然抗体。•同时哺乳动物细胞还能实现抗体的分泌性表达，表达产物可分泌至无血清或无蛋白的培养上清中，为抗体的分离纯化提供了最大的便利。此外表达抗体的哺乳动物细胞也能进行规模化培养，为抗体的产业化相应用奠定了基础。哺乳动物表达细胞•但哺乳动物细胞表达体系存在构建周期长、操作烦琐，表达产量相对低，生产成本较高等缺点。因此、尽管哺乳功物细胞表达体系能用于各种基因工程抗体的表达．但最适合表达的还是全分子抗体．以及某些不适宜在非哺乳动物细胞表达的小分子抗体。哺乳动物细胞表达体系包括宿主细胞和表达载体：目前常用的宿主细胞主要有两类，一类是淋巴类细胞，另一类是非淋巴类细胞。一、淋巴类细胞•在体内抗体是由浆细胞分泌产生的，浆细胞具有抗体正确折叠，空间构象形成，链内及链间二硫键形成的内环境，包括内质网及参与此过程的各种协向因子和分子伴侣(加重链结合蛋白BiPGRP78，二硫化异构酶等等)，而且还合完成抗体恒定区糖基化等翻译后加工修饰的细胞器、蛋白及代谢产物；因此浆细胞应是最适合表达重组抗体的。但浆细胞不能在体外长期培养，永生化或恶性转化的浆细胞瘤和骨髓瘤细胞系对于表达重组抗体是最接近浆细胞的，这些细胞同浆细胞一样能提供抗体表达所需的全套协同因子、分子伴侣以及糖基化等加工机制。•因此能用于表达各种重组的基因工程抗体。但是有的骨髓瘤细胞系本身也产生免疫球蛋白链，大多为κ轻链，选择时应首先考虑用那些本身不产生免疫球蛋白肽链的骨髓瘤细胞系。•由于目前尚无稳定但自身不分泌Ig的人骨髓瘤细胞系，因此，用于表达基因工程抗体的淋巴类细胞，主要是小鼠和大鼠的骨髓瘤细胞。•目前在表达基因工程抗体最多的骨髓瘤细胞是小鼠骨髓瘤细胞系SP2/0和NSO，以及大鼠的骨髓瘤细胞YB2/0。这些骨髓瘤细胞均不产生和分泌任何免疫球蛋白。SP2/0细胞系是小鼠骨髓细胞p3—x63—Ag8与经绵羊红细胞免疫的小鼠脾淋巴细胞融合而成的杂交瘤，再经培养和药物筛选发生变异后获得的细胞系。SP2/0是在表达基因工程抗体中用得最广泛的淋巴类细胞，尤其在人—鼠嵌合抗体的表达中用得最多，仅其表达产量通常较低，多用于实验研究。•NSO细胞系是能在胞内合成κ轻链的NS—1细胞的变异株，不再产生任何免疫球蛋白链，能用于表达各种全分子抗体，用该细胞系表达的抗人EGF受体的人源化改型抗体己在三期临床试用中。•此外，也有用小鼠骨髓瘤P3UI细胞表达人—鼠嵌合抗体。用于表达重组抗体的大鼠骨髓瘤细胞仅见有YB2/0细胞的报道，该细胞系是大鼠骨髓瘤细胞Y3与A0株大鼠脾细胞融合建立的，本身也不表达任何免疫球蛋白肽链。用骨髓瘤表达重组抗体时，所用的表达载体通常多选用免疫球蛋白的启动子和增强子，因这些细胞中含有它们所需要的转录因子，有利抗体的高表达。二、非淋巴类细胞•多种非淋巴类细胞都已被用于表达重组抗体，其中包括中国仓鼠卵巢(Chinesehamsterovary，CHO)细胞、猴肾来源的COS细胞、神经胶质瘤细胞、嗜伤细胞、Hela细胞、BHK细胞等等．这些不同组织来源的不同类型的细胞，在蛋白质的糖基化中可能会有所差别，但到目前为止，尚未发现从这些非淋巴类细胞中表达的重组抗体有功能性的缺陷。非淋巴类细胞在表达重组抗体时若使用免疫球蛋自自身的转录调控元件，如启动子、增强子等，其表达效率低、出此常采用其他较强的启动子，如SV40早期基因和晚期基因启动子(Psv40-EL),CHO•人巨细胞病毒立早基因启动子(PhCMV-IE)，病毒长末端重复序列LTR等等。通常非淋巴细胞表达重组抗体的产量低于淋巴类细胞，大多数在lug／ml以下。但近十余年的研究表明，通过一系列现代分子生物学技术，尤其是高效扩增表达技术，可使重组抗体在CHO细胞中的表达产量达200ug/ml。•此外，CHO细胞遗传背景清楚；转染效率高；能适用于多种载体；能表达各种类型的重组抗体；可长期稳定传代并稳定表达有功能活性抗体；可用无血清或无蛋白培养基培养，有利于抗体的纯化；能进行大规模培养。因而CHO细胞已成为生物技术产业化培养的首选工程细胞系，目前已批准上市的基因工程抗体几乎都是在CHO细胞中表达的。COS•另一种常用于表达重组抗体的非淋巴类细胞是COS细胞，COS细胞是用sv40病毒的大T抗原转染猴肾细胞获得的一株能长期传代的细胞系，含有SV40复制子的重组表达质粒转染COS细胞后，其重组DNA并不整合到细胞的染色体上、而是以游离的形式存在于细胞浆内、并迅速大量复制达到很高的拷贝数；COS细胞也具有糖基化和装P配分泌抗体的功能。•因此表达的各种抗体具有抗体的功能活性：由于转染的外源DNA在COS细胞并不整合，而是以游离形式存在并复制，因此COS细胞最常用于抗体的瞬时表达。近年来COS细胞己用于筛选或检测新构建的新型抗体的活性及特征，也用于研究从噬菌体库中筛选的抗体基因在真核细胞中表达的功能和特点，还用于各种抗体突变体的筛选。而且，结构更为复杂的双特异性抗体也在COS细胞表达成功。•如抗人OKT3/转铁蛋白受体的双特异抗体在COS细胞成功表达，其产量和活性均优于在大肠杆菌中的表达。三、抗体的高效表达•治疗用基因工程抗体的临床用药量大，还远超过其它生物制品。以美国批准上市的治疗肿瘤的两种人源化抗体Rituxan和Herceptin为例，Rituxan一个疗程约需用药1.2g，Herceptin一个疗程约需用药0.88g，而正在临床试用的抗VEGF人源化抗体，一个病人的最大用药量甚至达到了7.8g，这些抗体类生物制品比细胞因子类生物制品用药量高出几万倍。因而基因工程抗体的高效表达已经成为其临床应用的最重要的先决条件之一，甚至已影响到基因工程抗体的研究开发。目前已上市的以及正处于临床试用中的基因工程抗体多达上百种，其中绝大多数那是在哺乳动物细胞中表达的，更确切地说，是在CHO细胞中表达的。以下将简要地叙述抗体在哺乳动物细胞高效表达所涉及的诸多要素(见表7-1)。抗体表达的策略•抗体在哺乳动物细胞中表达的过程是抗体的重组表达载体与宿主细胞之间相互作用的一个复杂过程，包括5个相对独立的环节：•①抗体基因在宿主细胞染色体上的定位，主要是指抗体基因在染色体上的整合位点以及抗体基因的基因剂量。•②抗体mRNA的转录，转录效率与mRNA的稳定性是其中最重要的因素。•③抗体基因的翻译。•④抗体的翻译后加工、组装。•⑤抗体的分泌；针对以上5个环节，设计相应的措施提高各环节的效率，有助于提高基因工程抗体在哺乳动物细胞中的表达水平。此外还有一些实际操作因素的影响，如高表达细胞株的筛选，生产细胞的稳定等等。（一）哺乳动物细胞表达抗体的载体系统•基因工程抗体的表达载体系统是获得高表达抗体细胞株的关键，在确定宿主细胞后，基•因工程抗体的表达产量很大程度上由共表达载体的各表达调控元件及组织方式决定。一般来说，表达载体含有以下几种基本元件：骨架序列、选择标志基因、表达盒以及一些特殊的调控序列。除骨架序列外，其它元件对抗体的高效表达均存在一定的影响。载体系统分类•根据工程细胞克隆中目的基因拷贝数能否扩增，表达载体可分为两类：•A可扩增表达载体系统。•B不可扩增表达的载体系统。•有一类特殊的选择标志基因可以在外界逐渐增高的选择压力下实现在宿主细胞染色体上的基因拷贝数的扩增，并且可以连带两侧的序列一同扩增，从而提高产量。二氢叶酸还原酶(DHFR)目前报道的基因工程抗体的高效表达载体系统无一例外地采用了可扩增表达的载体。上述的可扩增选择标志基因目前主要包括有二氢叶酸还原酶(dhfr)基因和谷氨酰胺合成酶(GS)基因，其中使用最久、最广泛、效果最好的dhfr基因。•dhfr基因编码的DHFR是细胞代谢途径中的一个重要的酶．当细胞缺乏此酶或此酶失活•时必须依靠在培养基中添加次黄嘌呤和胸腺嘧啶脱氧核核苷才能存活。•甲氨蝶呤(MTX)是DHFR的类似底物．可竞争抑制DHFR的活性。当环境存在高浓度的MTX，dhfr基因可自发在染色体上扩增共拷贝数，以产生更多的DHFR来维持细胞的正常代谢，当其扩增时，可以连带它两侧的序列一起扩增，dhfr基因共扩增的序列的大小通常比该基因要大许多，甚至可以达到上千个kb，足以包含其两翼的目的抗体基因，这种共扩增也就实现了目的抗体基因的基因剂量的扩增，从而极大地提高表达产量。•dhfr基因在CHO细胞中扩增时能在染色体上形成较稳定的多拷贝序列，存在于宿主细胞染色体中。因此选择可扩增表达系统时最好选择在CHO细胞中表达，另外．内源性dhfr基因的存在会降低外源性dhfr基因带动扩增目的基因的效果。因此应该选择dhfr基因缺陷的CHO-dhfr-细胞，以达到抗体的最高表达。谷氨酰胺合成酶(GS)•利用GS基因也可对目的基因进行扩增；GS基因是一种显性基因扩增选择标志基因，在染色体上可以有较高的扩增倍数，像dhfr基因一样，扩增时连带两侧序列一起扩增。在外界存在蛋氨酸磺酰胺(MSX)时。不表达或弱表达GS基因的细胞受到MSX的显性筛选死亡，而GS基因表达较高的细胞则能存活。细胞对MSX的耐受浓度与GS基因的表达水平呈剂量依赖关系，提高MSX的浓度将要求细胞有更高水平的基因表达．造成GS基因和目的基因的扩增，达到目的基因的高表达。表达载体的表达盒•每一个表达载体均带有目的基因的表达盒，表达盒一般包括启动子、克隆位点以及转录终止信号。•因为抗体分泌前导肽通常适用于多种抗体基因，所以还可以将抗体分泌前导肽也包•含在表达盒中。另外，还可以在抗体分泌前导肽前再加上一些特殊的表达调控序列。抗体基•因表达盒的组织形式己较为固定，但其中各元件的选择仍然有值得探讨的地方。1启动子•抗体基因表达盒中最关键的元件是驱动抗体基因表达的启动子以及相应的增强子。所有的真核启动子都含有两个基本组成部分，TATA盒和其下游的富含GC的序列，TATA盒确定了转录起始位点，富含GC的序列则决定转录起始频率，因而不同的启动子产生不同的转录起始频率。•目前使用的哺乳类细胞表达系统的启动于主要有病毒启动子，如SV40早期基因和晚期基因的启动子、人巨细胞病毒立早基因启动子、病毒的长末端重复序列(LTR)等；哺乳类动物细胞基因的启动子，如转录因于EF-1α的启动子、人干扰素-α的启动子、各种鼠IgG启动子等。2核糖体进入位点•启动子下游有真核的核糖体进入位点，它对于所有的抗体基因的表达都是必要的。真核的核糖体进入位点通常为GCCGCCA/GCCAUGG+4的共有序列，它通过调控核糖体