TAIL-PCR

TAIL-PCR技术2010年10月18日TAIL-PCR技术的原理反应条件和引物设计特点应用UnknownseqUnknownseqknownseq如何获得未知的侧翼序列PlasmidrescueInversePCR……获得侧翼序列的方法TAIL-PCR热不对称交错PCR技术ThermalAsymmetricInterlaced(TAIL)PCRUnknownseqUnknownseqknownseqSP1ADSP2SP3TAIL-PCR实验流程特异性引物–载体（或T-DNA）目标序列I--------SP1//------------------------//非目标序列较长的随机简并引物LAD利用SP1与LAD为引物进行预扩增（Pre-amplification）10次高特异性循环1次低特异性循环25次普通PCR利用SP2与AC1为引物进行第一轮的TAIL-PCR（PrimaryTAIL-PCR）利用SP3与AC1为引物进行第二轮的TAIL-PCR（SecondaryTAIL-PCR）特异性产物稀释10倍稀释40倍6-7次TAIL循环hiTAIL-PCR实验流程结合利用TAIL-PCR和抑制PCR的原理利用5’带尾巴的高简并倍数的LAD引物在靶序列上创造结合位点，并抑制两端均为LAD引物的非特异产物的扩增利用5’带尾巴的第1轮特异引物抑制短的特异产物的扩增利用nestedPCR提高扩增产物特异性利用nestedPCR提高扩增产物特异性CD利用2轮高温、1轮低温交替的超级PCR循环提高特异产物的扩增效率，降低非特异产物的比利用高稀释倍数降低非特异产物在下一轮作模板的比例抑制PCR的原理：当PCR产物两端有反向重复序列时，可配对形成茎环结构。茎的形成会影响其与引物的结合，从而降低扩增效率。茎的长度越长、环的长度越小抑制作用就越强。TAIL-PCR成功的三个重要环节1.引物设计2.退火温度3.反应循环程序1.引物设计特异性引物(specificprimer，SP)–与已知序列互补的巢式序列特异性引物–较高的熔点温度,Tm=58-68℃随机简并引物（Arbitrarydegenerate，AD)–按照物种普遍存在的蛋白质的保守氨基酸序列,设计长度相对比较短–较低的熔点温度,Tm=44-48℃较长的随机简并引物（LAD)hiTAIL-PCRTAIL-PCR随机简并引物序列AD1：TGAGNAGTANCAGAGAAD2：AGTGNAGAANCAAAGGAD3：CATCGNCNGANACGAAAD4：TCGTNCGNACNTAGGAAD5：NTCGASTWTSGWGTTAD6：NGTCGASWGANAWGAAAD7：TGWGNAGWANCASAGAAD8：AGWGNAGWANCAWAGGAD9：CAWCGTCNGATASGGAAD10：WGTGNAGWANCANAGA注：W=AorT;S=GorC;N=AorTorGorC以前的TAIL-PCRHiTAIL-PCR15-16nt简并数低Tm=44-48℃33-34nt简并数高5’端有一小段16nt的相同序列Tm=50-52℃hiTAIL-PCR特异性引物2.退火温度高严谨性循环(热不对称)–退火温度60-68℃较低严谨性循环(热对称)–退火温度44℃低严谨性循环–退火温度25-30℃3.TAIL-PCR反应体系10×Buffer2.5µldNTPs（2mmol·L-1）2.5µlspecificprimer（5umol·L-1）1µl(0.2µM)ADprimer（视简并数而定）1.0-4.0µMTaq酶0.5ulddH2Oupto25µl模板DNA20-30ng普通TAIL-PCR10×Buffer2.0µldNTPs（2mmol·L-1）2.0µlspecificprimer1ulLADprimer（1）AC1（1、3）5ul1ulEx-Taq酶0.5ulddH2Oupto20µl模板DNA20-30nghiTAIL-PCR反应顺序循环数本实验室第一轮TAIL-PCR第二轮TAIL-PCR第三轮15115112130193℃1，95℃194℃1，60℃1，72℃23094℃1，25℃3，rampingto72℃over3，72℃394℃30，68℃1，72℃23094℃30，68℃1，72℃23094℃30，44℃1，72℃23072℃894℃30，68℃1，72℃23094℃30，68℃1，72℃23094℃30，44℃1，72℃23072℃894℃30，44℃1，72℃23072℃8TAIL-PCR反应程序反应顺序循环数hiTAIL-PCRPre-amplificationPrimaryTAIL-PCRSecondaryTAIL-PCR122262147-893℃2，95℃194℃30，60℃1，72℃394℃30，25℃2，rampingto72℃over3，72℃394℃20，58℃1，72℃372℃594℃20，65℃1，72℃394℃20，68℃1，72℃394℃20，68℃1，72℃394℃20，50℃1，72℃372℃594℃20，68℃1，72℃394℃20，68℃1，72℃394℃20，50℃1，72℃372℃5TAIL-PCR电泳图921bp-423bp-hiTAIL-PCR电泳图片段的回收、测序及结果分析PCR产物直接测序pMD18-T连接克隆pMD18-T酶切图（EcoRI和HindIII)TAIL-PCR技术的优点TAIL-PCR技术的缺点TAIL-PCR技术的特点P1、YAC、BAC克隆插入片段末端序列基因的5’端侧翼序列基因的启动子序列T-DNA、转座子及反转座子插入侧翼序列TAIL-PCR技术的应用