药物分离纯化技术---制备色谱分离技术

1制备色谱技术制备色谱的特点：最有效的制备性分离技术；实验室规模、小批量生产、产业化制备；不同领域产品量不一样，阐明化学结构和生物活性，30－50mg足够，分析用标准品100mg以上，有机合成通常需要g级以上；薄层色谱柱色谱2制备色谱技术制备薄层色谱法a.设备简单，操作方便、分离快速、灵敏度及分辨率高；b.切割谱带更加方便；c.自动化：自动点样仪、自动程序展开仪、薄层扫描仪、多种强制流动技术、多种联用技术如傅立叶变换红外、拉曼、质谱等。3制备色谱技术常规制备薄层色谱PTLC薄层板制备为了增大上样量，增加了吸附剂用量。固定相：硅胶、氧化铝、纤维素、C2、C18等反相健合硅胶支撑：玻璃板或铝箔平均25m,5~40m硅胶H、硅胶G、硅胶F254、硅胶F365、硅胶P4制备色谱技术硅胶粒径范围影响：1.越细越均匀，分离度越高，但？2.粒径范围宽，分离效率低，怎么办？------薄层厚度的渐变薄层厚度从底部到前沿逐渐增加，这样展开剂的速度逐渐变慢，样品谱带在展开过程中逐步富集，可保持较窄的谱带。5制备色谱技术薄层板的制作方法：常采用湿法：平铺法和涂铺法。混合平铺涂铺器自然干燥一夜105-120℃活化黏合剂硅胶煅石膏或羧甲基纤维素钠水溶液6制备色谱技术薄层色谱条件选择操作参数流速展开模式分离距离样品量流动相选择性溶剂强度黏度展开缸类型薄层板和展开缸空腔体积比值温度蒸气相固定相薄层厚度颗粒大小质量开放型操作不连续7常用溶剂(1)电子接受体溶剂：苯、甲苯、乙酸乙酯、丙酮等；(2)质子给体溶剂：异丙醇、正丁醇、甲醇、无水乙醇等；(3)强质子给体溶剂：氯仿、冰醋酸、甲酸、水等；(4)质子受体溶剂：三乙胺、乙醚等；(5)偶极作用溶剂：二氯甲烷(6)惰性溶剂：环己烷、正己烷等。制备色谱技术8制备色谱技术上样和展开1.先用甲醇展开一次，除去可能存在的杂质；2.低挥发性溶剂溶解样品会引起样品带变宽，因此选用挥发性溶剂（己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯等），且溶剂极性尽可能小。3.样品浓度以能均匀分布于吸附剂表面不析出为宜，5-10%；4.带状点样，尽可能窄；如点样带太宽，可用高极性溶剂展开至点样带上方2cm处进行浓缩，然后将铺板干燥后再用展开剂展开。？9制备色谱技术样品检测a.有色物质直接观察斑点；b.荧光物质在紫外灯下观察；c.无色无荧光可在荧光板分离，紫外光下显示暗斑；d.喷显色剂，结构稳定且不易氧化物质可以用碘蒸气显色，可逆；10制备色谱技术常用显色剂：a.硫酸：硫酸:乙醇(1:1)溶液，喷后110℃烤5分钟，不同有机物显不同的颜色；b.0.05%高锰酸钾溶液，还原性物质显黄色，背景淡红色；c.酸性重铬酸钾：5%重铬酸钾浓硫酸溶液，必要时150℃烤薄层；d.5%磷钼酸乙醇溶液：喷后120℃烤，还原性物质显蓝色，再用氨气熏，背景无色。11制备色谱技术样品收集：a.切割：刮刀或与真空相连的管型刮离器；b.回收：极性尽可能低的溶剂洗脱，通常1g吸附剂用5mL溶剂，丙酮和氯仿常用，甲醇因溶解硅胶及其中含有的杂质不常用。c.4型玻璃沙芯漏斗过滤洗脱液，再用0.2-0.45m滤膜过滤。d.硅胶的黏合剂以及荧光指示剂等杂质，可用SephadexLH-20过滤纯化。12制备色谱技术常规制备TLC速度慢，效率低，如何提高？加压离心13加压制备OPLC弹性气垫，外压使没有气相存在，展开剂强制流动，展开速度加快制备色谱技术更细的固定相颗粒、更长的薄层板14离心制备CTLC离心力加速流动相，分离速度快，操作简单，占用空间小，使用溶剂少，可反复使用，可进行梯度洗脱，进样量大，一次分离量0.1-0.2g.制备色谱技术15不同制备TLC方法的比较制备色谱技术参数PTLCOPLCCTLC流动相迁移方法毛细作用加压离心薄层厚度/mm0.5-20.5-21-4分离长度/cm181812分离模式线形线形环形组分分开方法离线在线在线典型上样量/mg50-15050-30050-500分离谱带数2-52-72-1216常规柱色谱技术：可使用较大直径的色谱柱，更多的固定相，因此样品量可以更大；分离速度较慢，样品可能被不可逆吸附；不适合小颗粒的吸附剂？改进方法：减压、加压等制备色谱技术17柱色谱常用固定相(1)硅胶：官能团和分子的几何形状，对异构体的分离选择性远大于其他色谱方法。烷基卤素（FClBrI）醚硝基混合物腈叔胺酯酮醛醇酚伯胺酰胺羧酸磺酸掺杂硅胶：如硝酸银处理，对不饱和烃有好的分离效果。1%-10%的添加剂的水或丙酮溶液与硅胶混合，稍干后110℃干燥即可。制备色谱技术18(2)健合硅胶SiOH+ROHSiORSiOH+SOCl2SiClSiCl+RNH2SiNHRSiCl+RXMgSiRSiOH+R3SiXSiOSiRRR制备色谱技术19(3)氧化铝碱性氧化铝：其水提取液为pH9-10，常用于碳氢化合物的分离，从碳氢化合物中除去含氧化合物。中性氧化铝：5%乙酸处理，水提取液为pH7.5，适用于醛、酮、醌、某些苷以及酸碱溶液中不稳定成分如酯、内酯等化合物的分离。酸性氧化铝：2MHCl溶液处理，水提取液pH为4-4.5，适合于天然及合成酸性色素以及某些醛、酸的分离。制备色谱技术20(4)活性炭：分离水溶性物质吸附作用在水溶液中最强，用有机溶剂洗脱。对芳香族的吸附力大于脂肪族；对大分子吸附力大于小分子；对极性基团多的分子吸附力大于少的；易吸附气体“中毒”，用前需活化，120℃加热4-5小时；制备色谱技术21(5)聚酰胺：又称为锦纶或尼龙同时具有良好的亲水性和亲脂性；可溶于浓盐酸、甲酸，不溶于常见溶剂；含有丰富的酰胺基，与酚类、黄酮类、醌类、脂肪酸类物质形成氢键；还含有非极性脂肪链，双重保留机理；制备色谱技术22(6)大孔吸附树脂：苯乙烯和丙烯酸酯骨架结构决定树脂的极性：非极性、弱极性----苯乙烯或二乙烯基苯聚合而成；中等极性----甲基丙烯酸酯；极性、强极性----含氧硫基、酰胺基、氮氧等基团；吸附和分子筛分离相结合：网状结构，大比表面积制备色谱技术23大孔吸附树脂使用：用前需预处理除去杂质：回流法、水蒸气蒸馏法；渗漉法----乙醇丙酮等有机溶剂湿法装柱，浸泡12h后洗脱2-3倍柱体积，再浸泡3-5h后洗脱2-3倍柱体积，重复直到流出的有机溶剂与水混合不呈现白色乳浊现象为止，用大量蒸馏水洗去乙醇即可。如单独采用有机溶剂洗不尽杂质，则可用酸碱处理，2-5%盐酸、2-5%NaOH溶液浸泡，洗脱，水洗。制备色谱技术24(7)凝胶：交联葡聚糖Sephadex----葡聚糖和3氯-1，2环氧丙烷以醚健交联形成的三维空间多孔凝胶交联度大，孔小，吸水膨胀小型号以其吸水量的10倍命名，如SephadexG-25表示每克干胶吸水2.5g；引入羟丙基，为LH型烷基化葡聚糖凝胶，不仅可分离水溶性成分，还可分离亲脂性成分，常用于最后的纯化，除去微量固体、盐类和其他外来杂质，纯化过程中样品损失极小。制备色谱技术25甲基丙烯酸酯共聚物ToyopearlHW系列----乙二醇、甲基丙烯酸缩水甘油酯和二甲基丙烯酸季戊四醇酯共聚而成稳定性好，pH2-12；机械强度高，常用于加压柱色谱；在蛋白质、酶、核酸、多糖的纯化处理中应用较多；ToyopearlHW40可用于小分子物质的分离纯化，与SephadexLH20有相似的效果。制备色谱技术26琼脂糖凝胶----D-半乳糖和3,6位脱水的L-半乳糖连接构成的多糖链，100℃时呈液态，45℃下互相连接成线性双链单环的琼脂糖，再凝聚成琼脂糖凝胶。与1,3-二溴异丙醇在强碱条件下反应，生成CL型交联琼脂糖，稳定性更好，pH3-14（一般的琼脂糖pH4.5-9.0）；机械强度和筛孔的稳定性由于葡聚糖，流速较快。制备色谱技术27凝胶柱使用一般注意事项：(1)交联度决定凝胶孔径大小，孔径决定排除下限；(2)颗粒粗细很重要，细颗粒分离效果好，但流速慢，宜采用大直径柱，粗颗粒流速快，但分离效果差，宜采用小直径柱；(3)干胶用量需考虑溶涨度制备色谱技术溶涨度干胶用量＝hr228(4)干胶使用前需在5-10倍的去离子水中充分溶涨，倾倒掉小颗粒，减压排气。也可用煮沸的方法溶涨，速度快，可灭菌排气。(5)填充均匀，无空隙和气泡；(6)多次使用后，床体积减小或污染，可再生处理，即用水逆向反复冲洗，再用缓冲溶液平衡。制备色谱技术29(8)离子交换树脂----阳离子交换和阴离子交换价态高，交换能力强；价态相同，原子序数大能力强；两性物质的交换取决于物化性质和特定条件下的离子状态；制备色谱技术30离子交换树脂的一般原则----选择取决于被分离物质的电荷性质；强的使用范围宽，弱的分离生物大分子时，活性不容易失去；反离子，为了提高交换容量，选择结合力小的反离子；亲疏水性选择，一般分离大分子时，选择疏水性的基质，活性易保持；制备色谱技术31常规柱色谱的操作(1)装柱：干法和湿法；(2)上样：液体上样和拌样上样，样品带尽可能窄；(3)洗脱：始终保持洗脱剂液面高于柱床表面，可梯度洗脱；(4)流分收集：常采用固定体积收集法，结合TLC检验；(5)样品回收：减压蒸馏或重结晶制备色谱技术32干柱柱色谱干吸附剂，待分离样品配成浓溶液或吸附于少量填料上上样，洗脱液接近色谱柱底部时停止洗脱，挖出或切开色带。制备色谱技术时间短节省试剂玻璃柱尼龙柱33减压柱色谱减压促进溶剂流动。制备色谱技术34与加压相比，变换溶剂更加方便；吸附剂高度一般不超过5cm；分离过程中，逐渐增加洗脱剂中高极性溶剂的比例，开始阶段增加幅度较小(1%,2%,3%)，随后幅度逐步增大(5%,10%,20%等)，通常收集20-25个流分即可将所有成分洗脱。制备色谱技术35加压液相柱色谱技术(1)快速色谱法：约0.2MPa；(2)低压液相色谱法：0.5MPa；(3)中压液相色谱法：0.5～2MPa；(4)高压液相色谱法：2MPa；制备色谱技术36加压液相色谱制备分离方法的建立：(1)采用薄层色谱确定分离条件。对于快速和低压色谱，常用薄层色谱选择分离条件。硅胶薄层色谱确定正相色谱条件，反相硅胶薄层色谱确定反相色谱条件，一般选择Rf不大于0.3且具有较好分离效果的展开剂。制备色谱技术37(2)采用分析HPLC来确定分离条件。对于中压和高压色谱则需要用分析HPLC条件进行选择。优化条件时，寻求较小的容量因子(k’3)为原则，分离度需高于分析LC所需要的水平，满足制备型LC采用过载模式来提高效率。制备色谱技术212212rrvv＝12122212LrLrmm＝38进样量的影响实验室规模的制备，轻微过载，优点：(1)便于回收高纯度目标成分，纯度99%；(2)纯品几乎完全回收，回收率95%；(3)分离程序简单，不需要为了得到纯品进一步分析所得到的组分。制备色谱技术过载：低浓度时，进样量增加使得容量因子改变超过10％39浓度过载和体积过载制备色谱技术K不变，线性结果可预测K变化，非线性结果难预测40边缘切割与循环色谱分离－－分离不佳时制备色谱技术密闭进样器是将流经检测器的柱流出液通过多通阀连至泵的入口；交替柱循环装置是连接两根色谱柱，通过阀门将第二根色谱柱切割得到的样品再加到第一根色谱柱上循环分离。41中心切割制备色谱技术适当损失组分，但避免色谱峰两端微量组分的污染。42制备加压色谱设备要求(1)泵：流量大，压力不需要太大；(2)进样器：大样品环六通阀，环管细而长而不是短而粗，样品溶液低浓度，大体积；(3)色谱柱：装填均匀常采用柱床压缩技术即径向压缩和轴向压缩；(4)检测器：不需要高灵敏；制备色谱技术43快速色谱法简单易行制备色谱技术44低压和中压色谱法第七章制备色谱技术45制备HPLC制备色谱技术参数内径/mm长度/cm填料粒径/m柱效进样量/mg分析型柱4-5253.5,5500001半制备柱8-1025-505-10150005-50制备柱20-2525-505-20低大大制备柱2525-5010更低更大46生产级的HPLC(1)溶剂花费是最大成本，昂贵