2-1、超薄切片技术原理

超薄切片技术（透射电镜部分）第三部分:电子显微术透射电镜是利用电子束作为照明源，通过几级电磁透镜放大成像于荧光屏上，因而电子束本身的穿透力弱，在电镜观察之前，必须把样品切成700埃或更薄的切片；或把样品(细菌、病毒、单细胞之类)制成悬液；或把样品（如较硬样品）的表面制成复型等，我们把电镜观察的样品制备方法总称为样品制备技术。一、超薄切片技术用超薄切片法，可得到25埃左右的分辨率；同电镜本身早已达到2-3埃的分辨本领相比，还有相当大的“差距”。这种差距意味着许多结构细节尚未被人们发现和认识，同时也告诫人们不能满足现今已有的制样技术。一、超薄切片技术在电镜技术中，有两种分辨率：一种是电镜本身的分辨率，二是样品制备上的分辨率，同一台电镜，谁的样品制备得好，它就能使细节观察得更确切，更清晰，拍出更真实的照片。对于研究生物医学的工作者来说，研究和熟练地掌握制样技巧是极为重要的一环。一、超薄切片技术石腊切片机的最高水平可以把片子切到1-2微米。现代的超薄切片机从改进石腊切片机出发寻求途径。目前的超薄切片机可以以连续切片的方式把一个细胞切成几十片或几百片来进行电镜观察。一、超薄切片技术目前使用的超薄切片机主要是热膨胀式（瑞典LKB公司制造）和机械推进式（美国的Porter-Blum）两种，的为代表，与此同时，许多固定、包埋和染色技术的发展和应用，使超薄切片;去成为样品制备中最普遍，而又最基本的方法。超薄切片制样过程同石腊切片过程大体相似，它分为取材、固定、漂洗、脱水、渗透与聚合、切片等几个环节。一、超薄切片技术超薄切片技术——是为透射电子显微镜观察提供超薄样品的专门技术。它是生物学中研究细胞、组织超微结构常用的技术，也是生物学中其它电子显微镜技术，如电镜放射自显影、电镜组织化学以及免疫电镜技术等关键性的技术。这种技术在生物学的发展过程中占据重要的位置，目前有关生物体的各种细胞、组织的超微结构知识几乎都是这种技术提供的。一、超薄切片技术超薄切片术——是最基本的透射电镜样品制备技术。需要借助超薄切片机制备样品；切片的厚度小于100毫微米（一般在30-70毫微米）；被广泛用于揭示样品的超微结构。超薄切片术——是电镜细胞化学、免疫电镜、电镜放射自显影、X—射线微区元素分析等技术的基础，是研究生物医学样品的超微结构及其功能的有力工具。一、超薄切片技术长度单位的概念:光学显微术中常用的长度单位是：“微米”（μ）,电镜是研究超微观物体的工具,其分辨能力比普通显微镜大1000倍以上。在电子显微术中,通常用“埃”（A）或毫微米（nm或mm）来表示。它们之间的换算关系如下：1毫米（mm）=1000微米（μ）1微米（μ）=1000毫微米（nm或mu）1毫微米（nm或mu）=10埃（A）1毫米=103微米=106毫微米=107埃一、超薄切片技术超薄切片术——一般厚度在10-100毫微米的切片称为超薄切片，制作这种切片的技术，叫做超薄切片技术。超薄切片过程一般与光学显微镜的石腊切片过程原则上基本相似，也包括取材、固定、脱水、渗透、包埋、聚合、切片和染色等几个环节（图）。超薄切片操作过程更为细致与复杂，要求更为严格，而且所用的试剂及配制方法也有所不同。一、超薄切片技术超薄切片技术的步骤路线（1）取材与固定（2）梯度脱水（3）浸透与包埋（4）修块（5）超薄切片（6）染色一、超薄切片技术染色[目的]将重金属原子结合到细胞结构上使造成图像反差常用染色液重金属：铅盐（Pb）蛋白质，糖元，脂类（膜看得清楚）铀盐（U）大多数细胞成分均可超薄切片技术的应用：除了单独应用于组织细胞的结构观察外，还可与放射性同位素自显影、细胞化学、免疫电镜和电镜原位杂交等技术结合，用于不同目的的研究。超薄切片技术的应用超薄切片分为两大类：1、普通超薄切片术2、半薄切片术。一、超薄切片技术一、普通超薄切片术一、超薄切片技术普通超薄切片术指不需要特殊的冷冻条件的常规包埋切片技术。普通超薄切片的每一部分都是重要环节，都直接与样品的质量相关，而样品质量的优劣又与观察结果密切相关；为了得到可靠和满意的切片结果，需要步步谨慎和认真。一、普通超薄切片术（一）、取材和固定（二）、脱水和浸透（三）、包埋和聚合（四）、超薄切片（五）、电子染色一、普通超薄切片术（一）、取材和固定一、普通超薄切片术1、操作原则：取材和固定要遵照四大原则：“准”、“快”、“轻”、“优”的操作原则。准：样品块一般约有1mm3，要求取材的部位要准。快：动物被处死之后，机体内的组织细胞就脱离了正常的生存环境，细胞的自溶作用会导致其坏死，致使超微结构发生改变，为了把这种损伤减到最小，处死动物后，要争取在1—2分钟内完成取材(超过5分钟的样品最好不要再用)，并立即把样品浸入固定液中。一、取材和固定轻：样品的超微结构脆弱，为防止各种人为的损伤，在操作过程中要格外小心，最好选用新的锋利的解剖工具，操作尽量轻巧，以避免挤压。优：优质的固定是关键环节之一，遇到特殊情况时最好根据样品本身的要求，经过反复实验选用最佳的固定条件。一、取材和固定2．操作方法：(1)动物组织块处理方法：用乙醚使动物轻微麻醉，迅速解剖，准确地取下材料，立即浸入2％一5％戊二醛进行前固定，并用锋利的双面刀片将样品剁成1mm3的碎块，于4℃固定1小时以上。(如果需要更长时间的前固定，需适时更换新鲜的固定液，并尽可能在4℃冰箱中保存。)接着用缓冲液冲洗处理10—30分钟，以洗去前固定液，然后在4℃下，用1％四氧化锇(即锇酸)进行后固定l一2小时。一、取材和固定(2)单细胞的处理方法：一般指人工培养的细胞（包括悬浮或贴壁生长），对贴壁生长的细胞需要先用0.5％胰酶处理若干分钟，或用薄橡胶刷轻轻刮下，使细胞脱落。先离心，1000g，5—10分钟，弃上清液，加入缓冲液后再离心1次（条件同前），弃上清液。一、取材和固定3、固定的种类按固定液的成分划分可分为：1）单固定——就是只用戊二醛或四氧化锇固定，一般用于单细胞样品或易渗透的样品。2）双固定——指先用戊二醛或多聚甲醛作前固定，再用四氧化锇作后固定，这种方法效果好，应用广泛。3）多重固定——指联合使用三种以上的固定剂，以达到取长补短的目的。可以根据样品的需要进行选择。一、取材和固定按固定方式则可分为：1、原位固定、2、灌流固定、3、浸没固定等。其中浸没固定最常用，但对不易解剖的组织和对缺血、缺氧等敏感的组织，如：心脏、肺、脑等，用原位固定和灌流固定则可提高固定的质量。一、取材和固定1）原位固定——是指解剖过程之中，在摘取所需器官之前，即器官还在原位时，先用醛类固定液冲洗其外面的血液等杂质，并不断抽掉混浊液，同时用新鲜的预冷的固定液反复冲洗，直到组织适度变硬。这种固定方法的作用是，在保证器官本身血供的同时对器官进行整体的预固定。然后取下所需材料，依次浸入3％戊二醛进行前固定和1％四氧化锇进行后固定。2）灌流固定——是指将固定液注入血管，通过循环作用渗透到器官组织的内部，使其得到充分的预固定，再解剖取下所需组织，剁成碎块，做常规双固定。一、取材和固定4、缓冲液的选择和配制为了在固定过程中维持细胞本身的pH值和渗透压，以防止因样品收缩和膨胀等引起超微结构的改变，需用适当的缓冲液来配制固定液。一般常用缓冲液的pH在7.0-7.4之间，但根据样品的需要，也可以调到6.8以下或7.6以上。一、取材和固定缓冲液的种类:1、磷酸盐缓冲液，2、二甲胂酸盐缓冲液，3、醋酸巴比妥钠缓冲液，4、三甲基毗烷缓冲液等。最常用的缓冲液是：1、磷酸钠缓冲液2、二甲胂酸钠缓冲液一、取材和固定1．磷酸钠缓冲液：应用广泛。这种缓冲液有多种配方。2．二甲胂酸钠缓冲液：有异味和毒性，配制和使用时要格外小心，最好用通风橱。它不易被污染，在4℃冰箱中能保存较长的时间。这种缓冲液对细胞中的生化活性具有良好的稳定作用，常用于免疫电镜和电镜细胞化学样品的制备。迅速有效的固定是获取最佳超微结构的重要条件之一。一、取材和固定5、固定液的选择和配制固定的作用:是阻止细胞自溶、稳定细胞的化学成分和超微结构。因此选择渗透力强、效果好的固定液是关键所在。常用的固定方法：双重固定或多重固定。可以通过对样品的实际观察，来判断固定的效果和选择适宜的固定剂。一、取材和固定良好的细胞的超微结构在电镜下观察具备的特征：一、取材和固定细胞器形态特征细胞质膜三层结构清晰，没有断裂，层间隙基本均匀细胞质基质微粒均匀密布，没有空白区域粗面内质网腔呈扁平状，上面附着核糖核蛋白体颗粒线粒体外周双层膜和内嵴完整，无膨胀和收缩，基质致密，无空白区域细胞核双层膜完整，显示核膜孔，膜间隙均匀，核染色质浓密多种固定液如:醛类固定液，高锰酸钾固定液，四氧化锇固定液等。一、取材和固定1、戊二醛(C5H8O2)：特点：最常用的固定液。具有渗透快、能良好地保存结构、使用条件较随意，因而适用范围广。这些特长取决于戊二醛本身的分子结构，它的单体分子小，穿透力强，对数毫米的组织块也具良好的固定效果。一、取材和固定戊二醛是通过交联作用稳定细胞的结构的，对细胞膜系统、细胞骨架系统、糖原、核蛋白和细胞基质的固定效果较好。又因它具有两个醛基，所以能快速达到良好的固定。用戊二醛固定时，溶液的温度允许在4℃至室温之间，固定的时间短可几分钟至几十分钟，长可达几日，甚至数周，所以常用于样品的前固定、临床病理速检固定和野外作业固定等。一、取材和固定固定剂戊二醛（醛基和氨基反应）四氧化锇（锇与双键螯合）（1）戊二醛作用原理：醛基和蛋白质、磷脂中的氨基结合，把相邻的蛋白质交联起来，形成不可溶的网络，但对脂类保存效果差适合保存：蛋白质，核酸，多糖不适合保存：脂类分子量较小，渗透较快（两步：戊二醛+锇酸）前固定：戊二醛固定液（2.5%-4%）中4℃冰箱1~2h(中间0.5-1h可取出修块)后固定：锇酸固定液（1%）中4℃冰箱或室温1h固定液使用磷酸缓冲液配制而成，使用磷酸缓冲液可减少因组织渗透压改变造成的变形。固定液是样品的40倍常规固定商品戊二醛呈浅黄色，pH4.5—5.0，最好棕色瓶在4℃条件下避光保存。当戊二醛的颜色变至深黄，pH降至3.5以下时，说明已失效，不宜再用。一、取材和固定为了维持样品的生理渗透压，使用戊二醛时常用缓冲液配制成2％一3％，但对于有特殊要求的样品，可以在1％一5％之间选择。建议最好在临用之前配制新鲜的固定液，以提高效力。配制方法如下：戊二醛固定液的配制（以市售25％的戊二醛为例）固定液浓度取25％戊二醛（mL）用缓冲液（0.1mol/L）加至总量（mL）2％81003％121004％16100（使用棕色瓶，并保存在4℃冰箱中）一、取材和固定2、甲醛：甲醛分子量较小。在组织中渗透快。固定迅速。单独使用时。保存超微结构的效果较差。但能保存某些酶的活性。在电镜细胞化学中常采用。在一般样品固定时。有时甲醛与戊二醛混合使用效果较好。一般市售的甲醛中含有抗聚合的甲醇。影响固定效果。因此电镜样品使用的甲醛需用多聚甲醛粉末在使用前自行配制。一、取材和固定配制20%甲醛原液方法：称30克多聚甲醛粉末（先用乳钵研细再称），放入装有约130毫升去离子水的烧杯中，加热至60-70℃，边搅拌边加入1NNaOH10-20滴，至溶液透明，以上约需半小时。冷却后过滤，沉淀不到1%。然后加入去离子水至150毫升，放在4℃冰箱内备用。一、取材和固定3．多聚甲醛(CH2O)n：由多聚甲醛粉末配制2％-4％的固定液,较戊二醛固定液的渗透力更强，并且能良好地保存样品中酶的活性。常用于电镜细胞化学、免疫电镜和临床速检的前固定。固定时间在30分钟至几小时之内，固定温度以4℃为佳。一、取材和固定多聚甲醛粉末配制2％-4％的固定液配制方法：储备A液：多聚甲醛20g，加入重蒸水50mL，配制成40％多聚甲醛水溶液。（注：在通风条件下配制，加热65℃，充分搅拌后加几滴浓NaOH使溶液透明）。储备B液：0.2mol/L缓冲液(磷酸盐缓冲液或二甲胂酸盐缓冲液)工作液：A液10mL+B液50mL+重蒸水至100mL(必要时可用葡萄糖或蔗糖调节渗透压)。一、取材和固定4、四氧化锇(OsO4)：特点: