药物毒理学-药物的安全性评价试验方法1

第十三章化学致癌作用背部纤维细胞瘤切除的肝肿瘤一、化学致癌作用•致癌作用：指导致癌症的一系列内在或外部因素的多步骤过程，包括任何良性或恶性的肿瘤的起源或发生•致癌剂：能在人类或动物引起肿瘤的化学物质•直接致癌物或初发致癌原：指未经代谢或生物转化就足以激发致癌效应的母体化合物•前致癌剂：需要经过代谢或生物转化为另一种化合物，才能诱发致癌作用的化学物质•辅致癌物质：指当与其它致癌剂同时存在时，能增加后者致癌活性的化学物质，但其本身并无致癌作用。遗传毒性致癌物：大多数化学致癌物进入细胞后与DNA共价结合，引起基因突变或染色体结构和数目的改变，最终导致癌变，这类毒物作用靶部位是机体的遗传物质，称为遗传毒性致癌物。非遗传毒性致癌物：通过促进细胞的过度增殖，改变细胞的克隆扩增而发挥致癌作用的药物，并不直接作用于遗传物质，因而称之为非遗传毒性致癌物。石棉、免疫抑制剂、激素、促癌剂等体细胞突变学说非遗传毒性致癌作用二、化学致癌机制（1）体细胞突变学说：认为肿瘤的发生与体细胞突变有关，即正常细胞在致癌物质的作用，其基本遗传物质DNA结构和功能发生改变，引起癌变。内涵：癌症是细胞水平的遗传改变肿瘤在本质上是纯系的许多致癌剂或其活性代谢产物与DNA形成共价键导致突变受影响的个体基因中某些隐性突变遗传具有基因组队癌症完整的易感性大多数癌症显示染色体畸变肿瘤细胞的显性特征能通过DNA转染而转移给非肿瘤细胞。化学致癌作用的分子机制癌基因：指一类在自然或实验条件下具有诱发恶性转化的潜在基因，它们是化学致癌作用的主要靶分子，在细胞癌变过程中起着关键作用。原癌基因：指机体内正常细胞所具有的能致癌的遗传信息。原癌基因发生恶性转化即形成癌基因。抑癌基因：指正常细胞分裂生长的负性调节因子，其编码的蛋白质能降低或抑制细胞分裂活性。化学致癌过程•引发阶段：化学致癌物对靶细胞DNA产生损伤作用，经细胞分裂增殖固定下来，造成少量细胞发生不可逆的遗传性改变，成为突变细胞。•促长阶段：促进引发形成肿瘤细胞分裂生长的作用阶段。•进展阶段：在肿瘤形成过程中，促进过程中，细胞表现出不可逆的遗传学改变，其标志为衣穿不稳定性增加和恶性变化。化学致癌过程生物化学改变正常DNADNA受损肿瘤DNA肿瘤RNA肿瘤蛋白质促癌剂正常DNA修复突变细胞学改变正常细胞肿瘤细胞肿瘤细胞分裂增殖可见的肿瘤致癌因素（2）非遗传毒性致癌过程•化学物对DNA以外的靶点所起的致癌作用成为非遗传毒性机制，或非突变学说特点：肿瘤促进剂的化学本质不具有致癌性。它们并不与DNA结合，而是通过提供一个选择生长的有利条件，使得被激发的纯系细胞生长。三、致癌物的分类遗传毒性致癌物：直接致癌物：烷化剂、亚硝胺类前致癌物：偶氮化合物、乌拉坦无机致癌物：重金属非遗传毒性致癌物:促癌剂：糖精、巴豆油细胞毒物：氯仿激素：己烯雌酚免疫抑制剂：硫唑嘌呤过氧化物酶体增生剂：三氯乙烯四、化学致癌活性试验1、致突变试验：主要是对致癌物的初步筛选•依据：化学物的致突变性与致癌性具有一定内在联系•缺点：无法检出非遗传毒性致癌物（假阴性）和具有遗传毒性的非致癌物（假阳性）•优点：可检出基因遗传毒性的致癌物（一）短期试验细菌回复突变试验果蝇伴性隐性致死试验染色体畸变试验微核试验2、细胞转化试验•细胞转化：指受试物与正常细胞在体外接触，如有致癌作用，可使正常细胞形态、功能发生变化，发生与癌细胞相似的过程。•观察终点：恶性变细胞（如细胞的形态改变、核发生变化等）•优点：可检出遗传毒性致癌物和非遗传毒性致癌物。3、哺乳动物短期致癌试验•小鼠肺肿瘤诱发试验•小鼠皮肤肿瘤诱发试验•雌性大鼠乳腺癌诱发试验•大鼠肝转变灶试验试验方法：给予动物受试药物后，多次持续给予促长剂，在20~30周左右观察局部组织（如肺、肝、乳腺、皮肤等）有无肿瘤发生。（二）慢性动物试验1、动物选择易感动物新生动物雌雄各半（一般情况）数量较多2、剂量设计•一般设3个染毒剂量（无作用剂量组、阈剂量组、发生肿瘤的剂量组）和一个对照组3、试验期限与染毒时间•长期或终生：试验周期因不同物种生命周期的不同而有差异。4、结果的观察、分析与评定（1）肿瘤发生率（2）多发性（3）潜伏期（三）流行病学调查•流行病学调查是判别化学物是否为动物或人类致癌物的唯一手段•通过临床观察发现怀疑动物或人类致癌物，再进行分析性流行病学调查。第十四章药物生殖和发育毒性作用历史反应停(沙利度胺;酞胺哌啶酮)1957–61•生殖与发育毒理学是研究毒物对亲代的生殖功能及子代发育过程的有害影响作用。生殖毒理学和发育毒理学常用术语•胚胎毒性:指在一定剂量下，药物对胚胎的选择性毒性作用。胚胎毒性具体表现：胚胎死亡、生长迟缓、功能发育不全、畸形•母体毒性：指在一定剂量下，药物仅对怀孕动物产生的选择性毒性作用。具体表现：母体体重减轻、某些临床症状、死亡•致畸性：指胚胎在器官发生期接触药物后，能够引起永久性结构或功能改变而引起畸形的作用。•致畸剂：具有致畸性并使出生缺陷发生率明显增加的物质称为致畸剂。•致畸指数：指药物对母体的半数致死量（LD50）与最小致畸量的比值。•生殖发育是哺乳动物繁衍种族的生理过程，其中包含生殖细胞发生，即精子发生和卵细胞发生、配子的释放、性周期和性行为、卵细胞受精、受精卵的卵裂、胚泡的形成、植入或着床、胚胎形成、胚胎发育、器官发生（或称器官形成）、胎仔发育、分娩和哺乳过程。生殖发育也可称繁殖过程。哺乳动物的生育繁殖过程第一节生殖毒理学干扰生殖发育的任何环节，并造成损害作用。可以通过对内分泌系统，特别是对性腺的作用，发生间接的影响。神经系统对内分泌功能也有调节作用，通过下丘脑-垂体-睾丸轴(下丘脑-垂体-卵巢轴)两条途径作用于生殖发育过程。外源化学物对生殖发育的影响外源化学物对生殖的过程的损害作用可以表现为不发情，发情周期紊乱或各种形式的性功能减退。雌性动物可出现排卵规律改变，卵巢萎缩，受孕减少，胚胎死亡，生殖能力的降低不孕或不育等。雄性动物可表现为睾丸萎缩或坏死，精子数目减少等。生殖毒性的评价生殖毒性的评价外源化学物对生殖过程作用的评定主要通过生殖毒性试验来进行。生殖毒性试验可以全面反映外源化学物对性腺功能、发情周期、交配行为、受孕、妊娠过程、分娩、授乳以及幼仔断乳后生长发育可能发生的影响。（一）雄性生殖毒理学雄性生殖毒性学•精子的产生•精子输送•神经系统•内分泌系统特定靶位—睾丸内环境与精子快速生成过程有关的细胞分裂和代谢活性，对某些类型的损伤特别敏感。药物特别容易损害DNA或影响快速生长组织需要的细胞蛋白或细胞呼吸。DNA损害：烷化剂蛋白质损伤：阿霉素、环磷酰胺、长春碱等下丘脑-垂体-性腺轴激素调节下丘脑-垂体-性腺轴雄激素黄体生成素（LH）促性腺激素释放激素（GnRH）乙醇、阿片制剂、抗高血压药普萘洛尔等（二）雌性生殖毒理学1、卵细胞毒性阻滞原始卵母细胞，影响进一步的成熟和排卵。如抗癌药--白消安。2、卵巢体细胞和生殖道毒性卵巢体萎缩—环氧树脂、呋喃妥因输卵管和子宫萎缩—镉3、生殖功能激素调节和相关毒性下丘脑-垂体-性腺轴促性腺激素释放激素（GnRH）黄体生成素LH促卵泡素FSH雌激素孕激素铅、林丹等第二节发育毒理学•研究发育生物体在受精卵、妊娠期、出生后直到性成熟的发育过程中，由于出生前，接触导致异常发育的理化因素或环境条件后的发病机制和结果。双头小猪臀部结合发育过程早胚期：容易引起胚胎死亡后胚期（器官发生期）:关键期胎儿期：生长迟缓、神经内分泌系统机能的改变。围产期：胎儿发育的后期和新生儿阶段。阶段接触毒物后的后果（一）自发流产和胚胎丢失•药物对早期胚胎发育毒性最明显的指标一般，药物影响早期胚胎的最终结果呈“全”或“无”模式，即胚胎细胞受到严重损伤而不能成活导致流产，若损伤仅涉及小范围的细胞死亡，则胚胎可完全修复不留任何异常。药物：抗肿瘤药、重金属、中药（活血化淤药）（二）胚胎毒反应•先天性缺陷：指出生前任何形态、生化或功能的异常。•致畸剂：指能导致先天性缺陷发生的化学物质药物：沙立度胺、异维A酸、己烯雌酚、四环素类、环磷酰胺等第三节毒性试验（一）一般毒性试验：检测药物对生殖细胞的发生和形成是否有影响。实验方法：1、动物：至少一种动物2、剂量与给药途径：高中低三个剂量组临床用药途径3、给药时间：交配前4、对照组：阴性对照、阳性对照5、观察与报告：动物的一般状况、体重变化、受孕率、死胎数、活胎重量、外观和内脏及骨骼的变化等。三段生殖毒性实验（二）致畸胎试验：确定药物是否具有胚胎毒性或致畸性。实验方法：1、动物：至少一种，首选大鼠2、剂量与给药途径：高中低剂量组临床给药途径3、给药时间：胚胎器官形成期内连续给药4、对照组：溶剂对照、阳性对照5、观察与检查：纪录孕鼠重、黄体数、死胎数、活胎数、活胎重、外观异常等。6、报告7、判定（三）围产期试验：检测药物对胚胎发育后期、母代分娩过程、哺乳和新生幼仔是否有影响。实验方法：1、动物：小鼠或大鼠2、剂量与给药途径：高中低剂量组临床给药途径3、给药时间：大鼠、小鼠于妊娠第15天开始给药，至分娩后21天（小鼠）和28天（大鼠）4、对照组：阴性对照、阳性对照5、观察与报告：观察动物一般状态、记录胎仔数、一般发育状况、外观畸形等第十五章药物遗传毒性作用一、遗传改变产生和潜在结果突变：指有机体遗传物质发生变化引起遗传信息的变化，并发生新的表型效应。自发突变：在自然条件下发生的突变。诱发突变：由人工利用物理因素或化学药剂诱发的突变称为诱发突变。遗传毒理学：研究理化因素引起遗传物质（DNA）改变，预测并防止潜在的有害效应。1、生殖细胞的遗传损伤危害•对后代产生致死性或非致死性的影响。非致死性效应表现为后代出现显性或隐形遗传性疾病。2、体细胞遗传损伤的危害•只影响接触到该诱变剂的个体。体细胞突变可能与肿瘤、衰老有关。•二、遗传损伤的类型•基因突变：基因中DNA序列的改变•染色体畸变：染色体结构的改变•基因组：突变基因组中染色体数目的改变。碱基改变单链断裂双链断裂链内交联蛋白质间交联DNA－蛋白质交联无碱基位点链间交联DNA损伤的常见类型遗传学终点•1983年提出致突变试验的遗传学终点分为五类：•DNA完整性的改变•DNA重排或交换•DNA碱基序列的改变•染色体完整性的改变•染色体分离改变1、第一阶段：六个试验•微生物回复突变试验•致突变哺乳动物培养细胞染色体畸变试验•啮齿动物微核试验•一般生殖毒性试验•生殖毒性动物致畸胎试验•围产期毒性试验特殊毒性试验分为三阶段2、第二阶段：八个试验基因突变试验-2个试验致突变性染色体畸变试验-2个试验DNA修复试验-2个试验动物短期致癌试验短期致癌试验哺乳动物培养细胞恶性转化试验3、第三阶段：动物长期致癌试验动物长期致癌试验三、致突变试验的方法致突变试验又称遗传毒理学试验，旨在检测化学物对生殖细胞和体细胞的致突变性，对遗传危害性作出初步评价，并预测其致癌的可能性。（一）鼠伤寒沙门氏菌营养缺陷型回复突变试验简称Ames试验，用于检测受试物诱发大鼠伤寒沙门氏菌组氨酸营养缺陷型突变株回复突变成野生型的能力。原理：利用一组鼠伤寒沙门氏菌突变型菌株，即一系列组氨酸缺陷型菌株，在加入哺乳动物肝微粒体酶活化的条件下，测定化学物质诱导回复突变成野生型菌株的能力。当营养缺陷型细菌回复突变为野生型时，细菌不能合成组氨酸到能合成组氨酸，从而能在不加组氨酸的培养基上生长。根据在不含组氨酸的培养基上生长的细菌集落数目，与对照组自发回复突变菌落数目相比较，来测定化学物质诱导微生物基因突变的能力。试验方法•菌株：组氨酸缺陷型伤寒沙门氏菌•药物浓度：最高浓度一般为5mg/皿最低浓度不小于有效浓度或给药量一般设5个以上浓度组•代谢活化：应用诱导剂处理后的哺乳动物肝微粒体酶（S9）•对照：阴性对照、阳性对照、S9平行对照•方法：标准平板法或预培养法，37C，48h观察结果。•结果判定：1、受试药物所诱发的回变菌落数增加，超过对照组2倍，并有剂量依赖性。2、某测试浓度超过阴性对照组2倍以上，结果具有重复性•Ames试验的优点：方法灵敏、简单，检出率高•缺点：微生物