《园艺植物遗传学》实验指导书

园艺植物遗传学实验指导书2008年5月1《园艺植物遗传学》实验指导书目录实验室工作规程………………………………………………………（1）实验一植物细胞有丝分裂的制片和观察…………………………（5）实验二植物细胞减数分裂的制片及观察…………………………（9）实验三染色体核型分析……………………………………………（13）实验四分离规律的验证……………………………………………（15）实验五独立分配规律的验证以及基因的互作观察………………（18）实验六连锁遗传现象的观察和交换值的测定……………………（20）实验七遗传力的估算………………………………………………（22）实验八染色体结构变异以及多倍体的观察和鉴定………………（24）2实验室工作规程一、守则为了获得准确的实验结果，避免在工作中发生差错和意外事故，实验者必须遵守下列规则。(1)实验前必须制订周密的工作计划，预习实习内容。进入实验室后要按照计划或指导教师的规定进行操作，并随时把实验中出现的情况和最后结果详细地记录下来。(2)遗传育种学实验中大多数是借助于光学显微镜，在细胞学水平上研究生物的遗传特性，所以实验室、工作台、各种仪器、用具、玻璃皿以及实验者的双手都必须保持洁净，做到无灰尘、无脏物，以免干扰镜下观察结果。(3)盛有化学药品、试剂、溶液的瓶上，必须贴有标签，注明名称、成分、配制日期，并分门别类，安放在一定位置上，排列整齐，便于取用。(4)挥发性药品、有毒药品、强酸、强碱等，使用时切勿靠近眼、鼻、口、衣服。酸类稀释时，只能将酸徐徐倒入水中，绝对不可将水倒入酸中。(5)取用液体药品时，所用各类量具必须分开，不可混用，用后必须马上冲洗干净；称量固体药品时，先在称盘上放清洁蜡光纸或白纸，调试平衡后再称，保护称具不受腐蚀和防止药品相混。(6)进行显微镜检查时，切勿使染料或药剂沾污镜头和镜台，如有沾污必须随时擦干净；并注意各种试剂不要洒在工作台上，以免腐蚀。(7)一切药品和化学试剂都必须按最低使用量配用，切勿浪费。用过的固体废物、酸类、碱类、染料等应倒入废缸内，不可直接倒入水槽中，废酒精、二甲苯、固定液等分别倒入一定的瓶中，以便回收再用。(8)实验中如有丢失、损失仪器设备及用具，应及时报告并填写报告单，凡不遵从教师指导违反操作规程以致造成不应有的损失者，按其情节轻重，态度好坏，给予处理，赔偿全部或一部分。(9)实验室必须保持安静整洁，不准高场喧闹、随地吐痰、乱扔纸屑和脏物。(10)离开实验室前，将所用过的仪器用具擦洗干净，并放回原处；关闭电源、水源，并指派人员打扫清洁。3二、显微镜的清洁与保养显微镜是遗传育种学实验中最重要的工具，必须注意防尘、防湿、防高温、防药品侵蚀。(1)提取镜箱时，必须右手提着镜箱，左手托着箱底，镜箱门朝着胸前一面；取显微镜时，必须右手紧握镜臂，左手托着镜底，防止显微镜滑落损坏。(2)显微镜取出后，先用软毛刷、纱布拂擦镜身的灰尘污物，各处缝隙及镜头上的灰尘，纤维等用洗耳球吹去，然后用擦镜纸试擦物镜和目镜头。擦时只能顺着一个方向多次抹擦，不能旋转抹擦，最后用细白绸把镜头再擦一次。(3)镜检时，低倍物镜只能作粗调旋调焦距，转换高倍物镜时，只能用细调螺旋焦距，切勿损坏镜头。(4)如果发现镜头被药物或者脏物沾污，应立即用擦镜纸浸沾少许二甲苯（以刚湿润擦镜纸为度）擦掉脏物或药液，并随即用擦镜纸擦干。(5)使用完毕后，同（2）进行清洁工作；转动物镜不要对着聚光镜，并降至最低点，放回镜箱，归还原处。(6)镜箱内干燥硅胶，必须定期更换。(7)显微镜必须与化学药物分开放置，严禁混藏。三、玻璃器皿的清洁1、器皿的清洁(1)将玻璃器皿放在搪瓷盆内加入适量的洗衣粉煮沸80分钟；(2)冷却后用清水洗干净，滤干水分；(3)放在洗涤液中泡30分钟；(4)再用清水冲洗干净，蒸馏水荡涤一下，晾干。2、新载玻片与盖玻片的清洁将新载玻片与盖彼片分别放在盐酸酒精中（95％酒精100份＋浓盐酸2份）浸泡4小时，再用流水冲洗干净，蒸馏水荡涤一下，滤干水分，放入95％酒精中备用。3、陈旧载玻片与盖玻片的清洁用过的陈旧载片与盖片、不适用的石蜡切片，清洁方法如下：(1)将以上各种玻片放在洗衣粉水中煮15分钟。4(2)在热水中洗去残留的树胶和脏物，把载片和盖片分开，按下列步骤分别清洗。(3)清水冲洗。(4)洗涤液中浸泡30分钟。(5)清水冲洗，蒸馏水荡涤一下。(6)95％酒精浸泡备用。擦试盖片时要小心，一只手夹住盖片两个边缘，另一只手持清洁纱布同时擦试两面，两指着力要均匀一致。5实验一植物细胞有丝分裂的制片和观察一、实验目的掌握植物组织细胞制片的方法，明确细胞有丝分裂过程中染色体的形态变化动态。二、原理植物根尖是细胞分裂的旺盛区，其细胞核内的染色体在8－羟基喹啉（或对二氯苯）作用下，刺激染色体收缩、变粗，且避免染色体在细胞中凝聚一团，再经过盐酸等物质处理，使细胞之间的壁溶解，固定杀死细胞，染色体经碱性染料染色后，即可制做永久片，观察有丝分裂各期的形象。有丝分裂是植物细胞增殖的主要方式，有丝分裂期间，细胞核内每一染色体均进行自我复制，分裂期间，染色体变化不同可分成紧密衔接的四个时期。前期：细胞核中出现染色体，细长缠绕成团，随后逐渐粗短。每条染色体是由两条共着丝点的染色单体组成，随着核仁核膜的消失而进入中期。中期：染色体逐渐集中于细胞中部，成一排于赤道面上。这时纺锤丝的一端连接染色体着丝点，另一端集中于细胞的极处构成纺锤体。由于染色体收缩，而形成明显的一定数目和形态的物质，因此，这个时期是染色体计数和形态观察的最适期。后期：每条染色体上的两染色单体，随着丝点的分离而分离。在纺锤丝牵引下，每条染色单体分向两极，成为独立的染色体，在两极方向上出现了数目与母细胞相同的染色体群。末期：染色体到达两极，染色体又伸长变细，恢复到间期的状态，核膜、核仁重新出现，随纺锤体解体，在细胞赤道板上形成细胞壁，成为两个细胞，完成有丝分裂过程。有丝分裂是均等的分裂过程，染色体一分为二，均匀分配到每个子细胞中，其结果，母细胞与子细胞，子细胞之间，染色体数目和组成完全相同，由此推断，生物细胞遗传物质的正确传递，与染色体准确复制和均等分配有关，支配生物性状表现的物质，主要存在于细胞核中的染色体上。三、仪器药品灯用酒精3瓶卡诺试剂蒸馏水封蜡封胶洗衣粉二甲苯1mol/L盐酸6附：1、醋酸洋红（及固定液）配方见压片技术部分2、8－羟基喹啉（0.002M）：取0.29克8－羟基喹啉先溶于少量乙醇溶液中，待完全溶解后浴于100ml蒸馏水中。3、对二氯苯饱和溶液：对二氯苯溶于水中，60℃水溶条件下4小时后，使保留少量末溶物为度即可。四、材料：蚕豆或洋葱根尖细胞。五、实验步骤：1、种子萌发：使萌发势较好的豌豆种子，在25℃-28℃条件下发根。一般实验前要清水浸洗数次，之后清水25℃-28℃浸种12小时，然后播于培养皿中，上下均用沙布垫着，水分以饱和沙布为度，36小时后萌发。2、预处理：待根尖长到0.5-1.5cm长时，一般在上午8:00-10:00，用刀片切下根尖置于0.002M8-羟基喹啉中（或饱和对二氯苯溶液中），室温2.5小时，否则失败，蒸馏水洗2-3次。显微镜24台酒精灯6盏沙布15×15ml36块擦镜纸1本石棉网6个温度计6支培养皿6个火柴6盒标签纸6张解剖针32个烧杯500ml36个载玻瓶200片镊子36个盖玻片200片吸水纸（大）3张刀片12个滤纸6盒量筒100ml6个剪刀1把针剂瓶40个容量瓶50ml1个浆糊1瓶棕色试剂瓶40个液管1ml6支玻璃棒6个小吸管36个8－羟基喹啉（或对二氯苯）乙醇（100％95％）3瓶恒温箱2个73、固定：把预处理，水洗后的根尖换上卡诺试剂固定（无水乙醇：冰醋＝3:1）,15~30分钟，蒸馏水洗2-3次。4、离析：换上1mol/L冷盐酸（室温）处理1分钟，再转入1mol/L盐酸（60℃恒温）浸泡25分钟，立即水洗2-3次，处理时间不能过长，也不宜过短。过长影响染色，过短细胞则不易分离分散。2.5％混合酶（纤维素酶：果胶酶=1:1,v/v）处理30分钟，离析的目的是为了使细胞中间层被酸水解，使细胞易于分离。5、染色镊取根尖，取下1-2mm长的分裂区组织于载片上，用吸水纸吸去过多液体，滴上一滴醋酸洋红，3-4分钟后压片。材料不能太多，否则堆积后压片效果不佳，观察困难。染色时间可根据室温和具体制片效果而定，室温高，时间短些，室温低则相应长一些。轻轻盖上盖玻片（用沙布擦，将周围擦干净），用左手大拇指压紧盖片左下角，用铅笔的橡皮头弹击压有材料的盖片部位，直到中部的材料分散成雾状为最好。离析的成败，直接关系到压片的效果，离析不完全时，往往会使材料聚积不散。此后用吸水纸吸去过多染液，于显微镜下观察。有保存价值的片子可暂用封蜡封好，以作永久性制片保留来用。最好能贴上标签，避免混淆，在标签上注明材料、分裂期、姓名、时间。六.作业1、每人交有丝分裂封蜡片1-2张。2、根据自己制片画有丝分裂中期和后期细胞图1-2个。8实验二植物细胞减数分裂的制片及观察一、实验目的：1、了解植物花粉母细胞减数分裂时相关形态特征，掌握取材标准，固定、染色和制片方法。2、了解分裂的全程及各个时期染色体的形态变化。二、实验原理：减数分裂是染色体数目减半的有丝分裂，也叫做成熟分裂。生物体在整个发育过程中，生长发育到一定阶段进入性成熟。先分化出大小孢子母细胞，进行减数分裂，然后产生雌雄配子或性细胞，雌雄配子结合（即受精）后，成为受精卵。减数分裂包括连续两次的细胞分裂过程，每个母细胞共形成四个子细胞，在高等植物中减数分裂开始的细胞是花粉母细胞及胚囊母细胞，减数分裂的直接产物是小孢子和大孢子，由于染色体只是在第一次分裂前的同期复制过一次，而细胞却分裂了两次，结果每个子细胞中的染色体就比原来细胞减少一半。这两次连续的分裂都可分为紧密衔接着的前期、中期、后期和末期。第一次分裂的前期变化最为复杂，又可分为细线期、偶线期、粗线期、双线期、终变期。前期I细线期：核内出现明亮空腔，染色体呈细长丝状，首尾难分，互相缠绕，靠近核的一边，部分细丝则向核的另一边发散，如花束状，在电子显微镜下可以看到染色体成双的状态。偶线期：此期开始时，同型（同源）染色体上相对应的位点都非常准确地靠在一起，好象“拉练”一样，同型染色体这种相互吸引和纵向靠拢称为联会。这是减数分裂和有丝分裂中染色体行为的主要区别之一。由一对同源染色体联会在一起的单位叫做二价体，每个二价体包含着4根染色单体，故称为四合体，其中来自同一染色体的两根染色单体，叫做姐妹染色体，来自不同成员的染色单体，互称为非姐妹染色体。粗线期：配对的染色体随着螺旋化的加强而逐渐缩短变粗，染色体的个体性也逐渐明显。在这个时期姐妹染色体之间可能发生片段交换，四合体中的四个染色单体，某一相对位置同时发生断裂而后差错地“愈合”，彼此交换了片段，染色体交换是生物变异的重要来源之一。9双线期：同型染色体的两个成员之间开始互相排斥而彼此分开，但发生过交换的部位仍粘连在一起，形成交叉结。交叉结的数目多少不定，一般在1一3个之间，所以双线期联合起来的染色体好象“麻花”一样。终变期：配对染色体的两个成员之间彼此排斥分离，使交叉结逐渐向两端移动，这种现象称为交叉移端，随着移端过程的进行，交叉结数目减少，最后只在末端相连，这时染色体高度浓缩，各二价体向核的四周扩散，因此是染色体计数的良好时期。终变期末，核仁、核膜逐渐消失，乃进入中期。中期I：核仁、核膜完全消失，所有的二价体都排列在赤道板上，每对同型染色体的两个着丝点分别向着相对的一极，这个时期如果从极处向赤道面上观察，染色体的数目是比较容易计数的。后期I：二价体的两个成员开始分开，在纺锤丝的作用下，分别向两极移动，使得两端子细胞中的染色体数目减少了一半，注意这时每根染色体包括两根染色单体，其着丝点尚未分开，此时每对同型染色体中的两个成员必然分离，而非同型染色体之间则以同等机会随机结合，进入不同子细胞中，这是后代变异的重要来源。末期I：分向两极的染色体又聚合起来，核仁、核膜开始形成，于是一个母细胞分成了两个细