15 病毒总论

医学微生物学MedicalMicrobiology病原学教研室：王玉Tel:6222493;E-mail:[e-mail]病毒学总论思考题•什么是病毒？•病毒区于细菌、真菌的特征是什么？•感染病毒的分离增殖方式有哪几种？•病毒感染的检测方法有哪几种？•病毒感染的防治措施是什么？病毒与病毒学病毒（Virus）是一种体积小，非细胞形态的微生物,其基因组只含有一种类型的核酸(DNA或RNA)。病毒体内缺乏产生能量的酶系统,只能寄生在活细胞内,依靠宿主细胞提供原料和酶系统,以复制方式进行增殖。病毒学（Virology）就是研究病毒的本质、病毒与宿主相互作用和规律的一门生命科学。•病毒的重要性1多70%急性传染2高发病率高死亡率高一生200次3新不断出现新的疾病老年性痴呆与朊病毒疯牛病4致畸5转化肿瘤HPVHSV—子宫颈癌HBV—肝EBV—鼻咽癌6无药无特效治疗药物主要内容•病毒的基本性状•病毒的感染与免疫•病毒感染的检测与防治病毒的基本性状•病毒的大小与形态•病毒的结构（核酸与蛋白质）•病毒的培养与增殖•病毒的遗传与变异•病毒的分类特性病毒细菌真菌滤菌器+±—结构非细胞原核细胞真核细胞细胞壁—++核酸类型DNA或RNADNA＋RNADNA＋RNA人工培养—++增殖方式复制二分裂有性或无性抗生素—++干扰素+——一、病毒的大小与形态病毒粒子（virion）•完整的成熟病毒颗粒，具有典型的形态结构，并具有感染性。•测量单位为纳米（nm,为1/1000m）50nm小型病毒50nm-150nm中等大小病毒（大多数）150nm大型病毒（最大300nm）•多数病毒呈球形或近似球形，杆状，丝状，少数可为子弹状、砖块状，噬菌体可呈蝌蚪状。微生物的大小比较葡萄球菌(1000nm）牛痘病毒300×250nmABCDEFG立克次体450nm衣原体390nmA、大肠杆菌噬菌体(65×95nm)B、腺病毒(70nm)C、脊髓灰质炎病毒(30nm)D、乙脑病毒(40nm)E、蛋白分子(10nm)F、流感病毒(100nm)G、烟草花叶病毒CaliciVirusHIVRhinovirusVSV:VesicularstomatitisvirusBacteriophageT4EbolaVirus二、病毒的结构•基本结构–核心Viralcore–衣壳Capsid•辅助结构–包膜Envelope–其他•病毒体Virion–核衣壳Nucleocapsid病毒体结构模式图壳粒衣壳核心（核样物）核衣壳包膜包膜病毒包膜粒子病毒核心//核酸（viralcore）•多样性DNAdsDNAssDNAdsRNARNAssRNA±分节段RNA±线状、环状•大小悬殊•复制方式多样•存在形式多样病毒核酸的功能•功能–病毒遗传变异的物质基础–决定病毒的种属特异性:克隆和表达–决定病毒的感染性：完整则有;•编码病毒结构蛋白和功能蛋白–大型病毒的核酸分子量相对大，能编码病毒的全部结构蛋白和病毒复制所需的许多酶–小病毒的核酸分子小，可能不编码这些酶，因此复制时要宿主细胞提供病毒核酸的特性•具有感染性–将提纯的病毒核酸（如肠道病毒RNA）如转至活细胞内，即可启动病毒复制而感染细胞，并从可感染细胞中获得子代完整病毒颗粒。•逆转录性–一些病毒颗粒中含逆转录酶，可以将病毒RNA逆转成DNA；•纯化裸露的＋RNA具有感染性？？•纯化裸露的—RNA则不具感染性？？•Verycondensedgenomes•有内含子，ORF间有重叠Overlappinggenes–Usingdifferentreadingframesreadingbothstrands病毒蛋白质——由病毒核酸编码•结构蛋白组成病毒体的成分衣壳蛋白包膜蛋白基质蛋白——连接衣壳蛋白与包膜蛋白的部分，有跨膜及锚定功能区•非结构蛋白病毒内——酶感染细胞内——特殊作用蛋白病毒衣壳（viralcapsid）•核心外的蛋白质–由壳微粒（capsomere）组成；它是衣壳的形态学亚单位，多肽分子是它的化学亚单位。•功能–保护病毒核酸，免受核酸酶的破坏–参与病毒感染细胞的过程•病毒表面蛋白+宿主细胞膜受体–具有抗原性核壳粒的排列方式•螺旋对称型（helicalsymmetry）•20面体立体对称型（icosahedralsymmetry）•复合对称型（complexsymmetry）五邻体六邻体六邻体五邻体纤突顶球RNA/DNA壳粒病毒包膜（viralenvelope）•是包绕在病毒核衣壳外面的脂质双层膜•主要成分是蛋白质、多糖及脂类，常以糖蛋白或脂蛋白形式存在•蛋白质是由病毒基因编码，多糖、脂类来自宿主细胞膜、核膜或空泡膜包膜特性与功能•有包膜的病毒以“出芽”（budding）方式释放时获得•包膜子粒（peplomere）或刺突（spike）赋予病毒特殊功能，如血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）•包膜病毒对脂溶剂（如乙醚、氯仿）敏感，能被消除包膜而失活（？？）——鉴定；它还与病毒的入侵途径相关（有－呼吸道；无－抗胆汁，肠道）。包膜功能–维护病毒体结构的完整性–具有介导与宿主细胞膜亲和及融合的性能–具有病毒抗原的特异性（刺突）–毒素样作用，包膜脂蛋白使机体发热、血压降低、全身中毒须触（触须样纤维）无包膜的病毒可有其他的特殊结构（如腺病毒）：在核衣壳的顶角上长出12根细长的须触，形状似大头针；功能：可凝集、毒害敏感细胞。病毒粒子的观察方法•电子显微镜（Electronmicroscopy）–Resolutionproblem:EMresolutionis5nm-anatomisabout0.2-0.3nmdiameter,analphahelixmotifis1nMdiameter,DNAis2nmindiameter.•X线晶体衍射（Xraycrystallography）•超过滤法•超速离心法Xraycrystallography三、病毒的培养与增殖CultureandReplicationofViruses病毒的培养方式•动物（Animals）•鸡胚（Embryonatedeggs）•组织培养（Organandtissueculture）Organculture胚胎EmbryocultureCellculture:原代细胞传代细胞双倍体细胞常用的培养细胞类型名称原代细胞培养恒河猴肾细胞培养，人胚肾、肺等细胞培养，鸡胚成纤维细胞培养二倍体细胞株WI-38（人胚肺细胞株），HL-8（恒河猴胚细胞株）传代细胞系Hela细胞，Detroit细胞（胸骨髓细胞系），ChangC/I/L/K（人结膜C，肠I，肝L与肾K细胞系），Vero（绿猴肾细胞系），BHK-21（幼地鼠肾细胞系）•细胞病变(Cytopathiceffect,CPE)•包涵体（InclusionBodies）病毒在培养细胞的细胞效应正常BHK-21CPE//BHK-21狂犬病毒包涵体——内基小体（Negribody）巨细胞病毒包涵体病毒数量和感染性测定1、蚀斑试验2、ID50或TCID50病毒感染鸡胚、动物或细胞后，引起50%发生死亡或病变的最小量。病毒感染单层细胞后，产生的局限性病灶，称蚀斑（CPE)；蚀斑是由一个感染性病毒体增殖形成的，即为一个蚀斑形成单位，病毒悬液中的感染性病毒量以每毫升的蚀斑形成单位PFU来表示。病毒的增殖•活细胞–敏感细胞•复制(replication)：–以病毒基因为模板,藉DNA多聚酶或RNA多聚酶及其它因素的作用,指令细胞停止合成细胞的蛋白质与核酸，转为复制病毒的基因组，转录、转译出相应的病毒蛋白，最终释放出子代病毒。病毒复制周期•复制周期（replicationcycle）–吸附、穿入、脱壳、生物合成、装配与释放–病毒本身没有独立的蛋白合成酶系统，必须借助宿主细胞的蛋白合成体系合成病毒蛋白•病毒复制周期时间因病毒而异–腺病毒25h–小RNA病毒6-8h–流感病毒15-30h•吸附:①静电结合:非特异，可逆的；０～３７℃，Na+、Mg+、Ca+等有关;②受体结合:病毒表面接触蛋白+易感细胞受体特异,不可逆;３７℃,化学反应。eg.犬类不感染麻疹,而人不感染犬瘟病毒*一种细胞上不可能具有全部病毒受体，只有细胞表面存在该病毒受体时，才能发生感染。*阻止吸附是目前预防病毒感染的重要研究课题之一。消除细胞表面受体阻止病毒与受体接触，或特异抗体穿入（Penetration）•吞饮（pinocytoticvacuole）–无包膜病毒被宿主细胞吞噬，进入胞内•融合（fusion)–有包膜病毒的包膜与宿主细胞膜直接融合，病毒核衣壳进入细胞•直接穿入脱壳:在溶酶体酶作用下脱壳,释放基因组核酸。HIVinfluenzavirus生物合成（Biosynthesis）•早期蛋白合成阶段–转录、翻译而产生病毒生物合成中必需的酶类及某些抑制或阻断细胞核酸和蛋白质合成的非结构蛋白•晚期蛋白合成阶段–复制病毒核酸，转录、翻译而产生病毒的结构蛋白•隐蔽期–生物合成阶段用电镜方法在细胞查不到完整病毒，用血清学方法也测不到病毒抗原–各病毒隐蔽期长短不一，如Poliovirus为3～4小时，而Adenovirus为16～18小时。装配（Assembly）•无包膜病毒–先形成空心衣壳，核酸从衣壳裂隙进入形成核衣壳•有包膜病毒–核衣壳与细胞的膜系统（浆膜或核膜）结合形成包膜–包膜的蛋白质（包括糖蛋白）是由病毒基因组编码，故具有病毒的特异性和抗原性•装配的部位–除痘病毒外，DNA病毒均在细胞核内装配–RNA病毒与痘病毒则在细胞浆内装配释放（release）•无包膜病毒–均以破胞方式释放•有包膜的病毒–以出芽方式释放到细胞外–通常细胞不死亡，仍能继续分裂增殖dsDNA病毒复制示意图dsDNAvirusReplicationViralgenomeTranscriptionEarlymRNATranslationEarlyproteins(enzymes)Semi-conservativetranscriptionTranscriptionLatemRNATranslationLateproteins(structuralproteins)ReleaseExamplesVacciniavirusHSVAdenovirusPolymavirus+ssRNA病毒复制示意图+ssRNA逆转录病毒复制示意图ADSORPTIONbuddingHIV复制过程疱疹病毒的复制过程病毒增殖异常•缺陷病毒（Defectivevirus）•顿挫感染（Abortiveinfection）•干扰现象（Interference）•缺陷病毒（defectivevirus）：病毒遗传变异的突变或基因工程操作，使病毒基因不完整或基因位点改变，影响了病毒复制或成熟的一个或几个基因功能，不能复制出完整的具有感染性的病毒颗粒。•天然缺陷病毒：–腺病毒相关病毒（缺陷病毒）与腺病毒（辅助病毒）–丁型肝炎病毒（缺陷病毒）与乙型肝炎病毒（辅助病毒)•缺陷干扰颗粒（defectiveinterferingparticles,DIP)缺陷病毒不能复制，但却能干扰同种成熟病毒体进入细胞。•干扰现象interference——当两种病毒同时感染同一细胞时，可发生一种病毒的增殖抑制了另一种病毒增殖的现象。•产生原因——干扰素interferon，IFN——第一种病毒改变了宿主细胞表面受体结构或细胞代谢途径；或抑制第二种病毒mRNA的转译。——缺陷干扰病毒（DIP）干扰辅助病毒的复制意义指导使用联合疫苗辅助病毒helpervirus——能提供给缺陷病毒所需要的因子（主要是酶、蛋白质）的病毒。缺陷病毒+辅助病毒——增殖•顿挫感染（流产性感染）：有些细胞不能为病毒复制提供必须物质，不能复制出具有传染性的病原体，这种感染过程为流产性感染；这种细胞为非容许细胞（non-permissivecell）。•容许性细胞•非容许性细胞顿挫感染（Abortiveinfection）•原因–宿主细胞不能提供病毒复制所需的酶、能量