3α羟基类固醇脱氢酶(HSD)

3α-HYDROXYSTEROIDDEHYDROGENASE3α羟基类固醇脱氢酶(HSD)本资料由北京奇松生物科技有限公司提供α类固醇脱氢酶（3-α-HydroxysteroidDehydrogenaseHSD）的活性检测方法。2.范围使用于HSD成品、半成品及其他样品的检测。3.职责质检部对本规程负责。4.定义U:在pH8.25,25度的环境下,每分钟生成1umolNADH所需要的酶量。活性:每毫升样品中的活性值。比活:每毫克蛋白的活性值。5.内容5.1原理Androsterone+NAD+5α-Androstane-3,17-dione+NADHNADH的生成可以通过340nm的光吸收进行检测。5.2试剂：ATris-HCl,25mM，pH8.25B雄酮溶液，20mMCNAD+溶液,10mMD酶稀释液：A溶液试剂的配制方法详见各试剂配制记录,配制人员需完整填写配制记录。5.3操作规程：5.3.1仪器参数设定若仪器中无已保存参数，按以下参数设定。若已有相关参数，调取后确认。检测方法：动力学扫描测量波长：340nm测量时间：120s延迟时间：60s积分时间：60s系数/因子：4.84测量温度：25±0.1℃5.3.2样品准备若待测样品为固体，按10mg样品/1000ul超纯水比例溶解。溶解后于2-8度放置30min。5.3.3检测方法5.3.3.1在石英比色皿中加入2.6ml试剂A,300ul试剂C于25度孵育2min。5.3.3.2加入100ul样品后,再加入10ulB溶液,温和混匀后开始测定。5.3.3.3测定结束后，记录相应数值：起始读数、△A/mintest、活性值（U/ml）。5.3.3.4活性值（U/ml）范围为U/ml，若超出范围，待测样品需经试剂D稀释后再次进行检测。5.3.3.5测定样品前需检测空白反应值，即其他操作不变，用100ulD代替样品加入比色皿后进行反应,测定△A/minblank。5.3.3.6计算公式活性(U/ml)=(△A/mintest-△A/minblank)×4.84×df（稀释倍数）5.4成品检测结果精密度要求：每个样品检测时，在线性范围内选择三个不同的稀释度进行测定，得到的原液/粉末活性,计算Cv值,Cv值得要求为5%,达到要求后,此次测定的结果认为有效,取三个检测数值的平均数作为最终的检测数值。若不能达到,对此三个稀释应进行重新检测。