Blue-native-PAGE-实验讲义

BlueNativePAGE一．实验原理：BlueNativePAGE（BN-PAGE）是HermannScha¨gger1991年创立的一种从生物样品（质膜，胞浆等）中分离蛋白质复合物的电泳技术。能分离10KD-10MKD范围内的蛋白质以及蛋白质复合物。BN-PAGE以考马斯亮蓝G-250代替SDS使蛋白质复合物带负电荷，根据各个不同复合物分子量不同从而在胶中得到分离。这些复合物在胶中以蓝色条带形式呈现。样品用一些温和的去污剂如dodecylmaltoside(DM),TritonX-100和毛地黄皂苷(digitonin)等溶解,从而使复合物以近似天然的状态分离。实验中若想进一步分析复合物各个亚基的成分，通常采用BN-PAGE结合SDS-PAGE的方式.实验结果如下图所示。二实验需要用到的试剂：咪唑（Imidazole），6-氨基乙酸（6-Aminohexanoicacid），聚丙烯酰胺（Acrylamide(twice-crystallized)），甲叉双丙烯酰胺.（Bis-acrylamide(twice-crystallized)），20%（W/V）TritonX-100，20%（W/V）dodecylmaltoside(DM)，20%（W/V）digitonin，甘油，5%（W/V）G-250（CoomassieblueG-250）,巯基乙醇（.Mercaptoethano）,过硫酸铵（AP），TEMED，氯化钠三溶液的配置AB-3mix:称48gacrylamide加入大约50mL的ddH2O中，搅匀后定容至100mL，再加入1.5gbisacrylamide，混匀，三层滤纸过滤后置于棕色瓶中保存。5%G-250溶液：0.5gG-250，0.6559g6-氨基乙酸溶于10毫升水中电极缓冲液和凝胶缓冲液的配方见表1样品溶解液的配方见表2分离胶和浓缩胶的配方见表3四实验流程：1.灌胶选择合适的玻璃板，用洗涤剂反复擦洗玻璃板，再用自来水反复冲洗，最后用双蒸水漂洗，自然晾干或者用吹风机吹干。隔条以同样的方法洗干净以后，自然晾干或用滤纸吸干。将玻璃板卡入隔条中，短板对负极置于电泳槽中，用1%的琼脂糖封胶。将电泳槽放在4度冰箱中冷却。按照表上所列的方法配好不同浓度的分离胶，用梯度混合仪灌胶。灌完胶后，用水饱和的正丁醇封住胶面，等待凝胶聚合。大约30分钟后，凝胶的表面出现两个界面，分离胶已经聚合，去掉表面的正丁醇层和水层，再用双蒸水冲洗胶面，直到没有正丁醇的味道为止。用滤纸小心的吸干胶面。按照表中的方法配好浓缩胶，灌胶，插入梳子，等待凝胶聚合。2样品处理不同的样品有不同的处理方法。现在以海马突触质膜为例讲解样品处理方法。从-20度冰箱里取出一管用1.5mLEP管装着的海马突触质膜样品，置于37度水浴锅中使其快速溶解。溶解后加入表二所示的solutionbufferA溶液，加到EP管最大刻度处。18000g冷冻离心20分钟，弃上清，取沉淀。称沉淀的重量。按照detergent/protein=3：1的比例加入20%TritonX-100溶液，使TritonX-100的终浓度为2%，用Tip头小心混匀样品，注意不能有气泡，冰上裂解30分钟。然后18000g冷冻离心20分钟，收集上清，测蛋白含量。取出120微克的样品，加入3微升5%G-250溶液和5微升50%的甘油，混匀后即可上样。所有操作均在冰上进行。3电泳将处理好的样品用微量进样器点在上样孔中以后，倒入1ⅹ负极液和正极液，插好电源，以恒压100V开始电泳，待样品跑过浓缩胶后，电压改为250V，之后可以慢慢增大，到样品最后跑完。只要控制电流在50毫安以内即可。待样品跑到凝胶的1/3处更换负极液，将原来1ⅹ负极液换成1/10ⅹ，这样可以降低胶的背景。负极液的配方见表一。电泳过程如下图所示：4固定和染色当样品跑完整个凝胶后，剥胶，固定和染色。这个过程和普通的SDS胶一样。即用固定液（50%ddH2O，40%甲醇，10%乙酸）固定30分钟后，水洗4次，15分钟一次。然后在考染液中染色过夜。5脱色，扫描染色过夜后，倒掉考染液，用双蒸水脱色，到背景十分干净为止，扫描。如果不要分析复合物各个亚基的组分，就可以直接拿BlueNative胶切胶，酶解后质谱鉴定。若还想进一步分析复合物各个亚基的组成，则还要做二向SDS-PAGE。五二向SDS-PAGE操作过程1灌胶选择合适的玻璃板，洗干净后按照上述方法灌胶。SDS-PAGE30%凝胶储液，分离胶buffer,浓缩胶buffer的配制见实验室自编教材《蛋白质组学核心技术实践指南》，凝胶浓度根据样品特性选择合适的浓度，凝胶浓度与其对应的分离范围见表3.1。本实验室常用的分离胶的浓度为11.5%，浓缩胶的浓度为4.8%，配方如下：11.5%分离胶4.8%浓缩胶30%凝胶储液5.75毫升0.8毫升分离胶buffer3.75毫升----------浓缩胶胶buffer---------1.25毫升双蒸水5.5毫升2.95毫升AP40微升20微升TEMED10微升5微升电极缓冲液的配置：Tris（MW121.14）3.03g，甘氨酸（MW75.07）14.4g，SDS1g，加双蒸水至1000ml2平衡将BlueNative胶根据条带的位置切成长条，置于含有1%SDS，1%巯基乙醇溶液中平衡2小时，水洗20分钟。3转移先煮琼脂糖（0.05g琼脂糖，10毫升电极缓冲液，30微升溴酚蓝），然后将平衡好的胶条摆在二向SDS胶的浓缩胶胶面上，用压胶片把胶条压紧，使二者紧密结合，并保证两个胶面之间没有气泡，再向胶面上封一层琼脂糖。4跑胶等琼脂糖凝固后，将玻璃板摆到电泳槽上，倒入电极缓冲液，以25毫安恒流开始电泳。等样品跑过浓缩胶后，将电流改为45毫安直到电泳结束。5银染①固定液（100毫升乙醇，25毫升乙酸，125毫升双蒸水）固定30分钟②将固定液倒掉，加入敏化液（0.5g硫代硫酸钠,17乙酸钠，75毫升乙醇，最后定容至250毫升）敏化30分钟③倒掉敏化液，加入双蒸水洗3次，每次5分钟④倒掉水，加入银染液（0.625g硝酸银加水至250毫升）染色20分钟⑤倒掉染色液，水洗两次，每次1分钟⑥倒掉水，加入显影液（6.25g碳酸钠，50微升甲醛溶于250毫升水中），3-5分钟以后即可看到结果⑦倒掉显影液，快速加入终止液（3.65gEDTA溶于250毫升水中）终止20分钟⑧倒掉终止液，加入双蒸水洗胶面注意：每步之间都要换干净手套，银染液配好后要避光。6扫描Tips:1样品处理是整个实验的关键，样品处理最重要的是去污剂的浓度以及去污剂和蛋白的比例，这个通常需要摸索，设置不同的浓度以及比例，最后选择最佳的。下图就是一个例子。2上样量不能太大，太大课样品会沉积在上样孔中不能下来。上样量是根据上样孔的大小以及胶的厚度来决定。3样品的盐离子浓度要非常低，否则会导致样品在上样孔中的沉积。如果样品的盐离子浓度很高，首先必须脱盐。4每个孔上样的样品体积不能超过上样孔容积的4/5，所以必须控制样品的浓度，浓度太低需浓缩。5所有操作必须在冰上进行，保证复合物的完整性。