丝氨酸蛋白酶水解机制

4.4.5丝氨酸蛋白酶水解机制什么是丝氨酸蛋白酶？丝氨酸蛋白酶是一个蛋白酶家族，其激活是通过活性中心一组氨基酸残基变化实现的，它们之中一定有一个是丝氨酸（Ser，serine）。在哺乳类动物里面，丝氨酸蛋白酶扮演着很重要的角色，特别是在消化，凝血和补体系统方面。最典型的三种丝氨酸蛋白酶：胰蛋白酶胰凝乳蛋白酶弹性蛋白酶同属消化酶系，在胰腺泡内合成并分泌到十二指肠中。均可催化肽键的水解反应，但对肽键的选择性则有所不同1.水解作用的动力学模型胰凝乳蛋白酶不仅可以水解肽键，同时也可以水解一般的酯键。以对硝基苯酚乙酸酯为例：对硝基苯酚乙酸酯乙酸对硝基苯酚胰凝乳蛋白酶这一反应过程具有两相特征：快速反应相：对硝基苯酚离子快速形成，与酶的浓度成正比。恒态反应相：对硝基苯酚离子形成较缓慢，形成速率恒定。（决定反应速率的关键步骤）快速反应相过程中酶和底物结合释放出对硝基苯酚离子，同时形成乙酰基-酶中间体；而恒态反应相过程则是乙酰基-酶中间体缓慢水解，放出酶，使之与底物相结合继续释放出对硝基苯酚离子。由于乙酰基-酶的水解很慢，使体系中酶浓度下降，进而导致对硝基苯酚释放速率变慢。2.酶活化中心必需基团的测定(1)活性Ser基团：二异丙基磷酰氯（DIPF）能特异性与Ser基团的-OH反应，其结果导致作为酶活性中心的Ser的残基发生不可逆失活，此方法可有效确定胰凝乳蛋白酶中的Ser-195是酶活性中心必需氨基酸残基。DIPF作用于动物上时，即可显示出很高的神经毒性，动物体内的乙酰胆碱酯酶（丝氨酸蛋白水解酶的一种）能够与DIPF反应，使其自身失活，失去对乙酰胆碱的水解作用。乙酰胆碱是一种生物体内常见的神经传导物质，自身具有很高的毒性，而负责水解完成传递信息任务后的乙酰胆碱的乙酰胆碱酯酶（乙酰胆碱酯酶可将乙酰胆碱分解成无毒性的乙酸和胆碱）失活之后就会导致乙酰胆碱在生物体内不断地积累，最终导致生物中毒死亡。(2)活性His（组氨酸）基团：N-对甲苯磺酰苯丙氨酸氯甲基酮（TPCK）其中氯甲基酮基是一个很强的烷基化剂，它能够与反应中心His-57的咪唑基发生烷基化反应，并最终引起酶的失活。(3)丝氨酸蛋白水解酶的空间结构：X射线衍射法：通常，都是将表达蛋白的基因PCR之后克隆到一种表达载体中，然后在大肠杆菌中诱导表达，提纯之后摸索结晶条件。结晶后，将晶体进行x射线衍射，收集衍射图谱，通过一系列的计算，很快就能得到蛋白质的原子结构。牛的胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶以及住的弹性蛋白酶在结构上很相似，这三种酶大约由240个氨基酸残基组成，三者的一级结构大约有40%是相同的，且活性中心的必需氨基酸也大致相同（Ser、His、Asp）3.催化作用机制（1）结构特性以胰凝乳蛋白酶举例，其活性中心有三个必需氨基酸残基：Ser-195，His-57和Asp-102，这三部分通过氢键结合，整体呈三角形，即所谓的“催化三元区”。“催化三元区”的最显著特征是Ser-195的羟基高度极化，具有很高的亲核进攻能力。（2）亲核共价催化作用——易形成四联体结构的中间物Step1：Ser-195作用于底物的肽键酰基，发起亲核进攻，形成一个包括Ser-195的羟基、底物酰基和氨基在内的共价四联体中间物。Step2：四面体中间物分解，即生成酰基-酶中间物并伴随着C-N键的断裂。R1NH2H2O肽键断裂之后，R‘-NH2基团作为离去基团从反应体系中离去，此时水分子进入，其氧原子攻击羰基上的碳原子，从而又形成了一个水分子参与的四联体中间物。Step3：酰基-酶中间物的解离，这时His-57作为广义酸起催化作用。