第11章 生物素-亲合素放大技术

第十一章生物素-亲合素放大技术第二节亲合素、链霉亲合素的理化性质与标记一、理化特性二、亲合素（或链酶亲合素）的标记第一节生物素的理化性质与标记一、活化生物素二、活化生物素标记蛋白质第三节生物素-亲合素系统的特点一、灵敏度二、特异性三、稳定性四、适用性五、其他思考题小结第四节生物素-亲合素系统的应用一、生物素-亲合素系统基本类型及原理二、生物素-亲合素系统在酶免疫测定中的应用三、生物素-亲合素系统在荧光免疫技术中的应用四、生物素-亲合素系统在放射免疫测定中的应用五、生物素-亲合素系统在分子生物学中的应用生物素（biotin）、亲和素（avidin）是一对具有高度亲和力的物质，结合迅速、专一、稳定并具有多级放大效应。BABBAABC生物素（维生素H）动、植物组织中广泛分布,卵黄和肝含量高分子量小，244.31DI环为咪唑酮环，可与亲合素结合Ⅱ环为噻吩环，C2上戊酸侧链的未端羧基是结合生物大分子的唯一结构I咪唑酮环Ⅱ噻吩环羧基:可用于活化为其他衍生物第一节生物素理化性质与标记一、活化生物素生物素侧链的末端羧基经化学修饰后制成带各种活性基团的衍生物－活化生物素(生物素化衍生物)为何要活化？活化生物素活化生物素易与抗原、抗体、酶及核酸分子中相应基团偶联形成生物素化标记物标记蛋白质氨基的活化生物素标记蛋白质醛基的活化生物素标记蛋白质巯基的活化生物素标记核酸的活化生物素活化生物素标记蛋白质氨基的活化生物素BNHS分子可与蛋白质赖氨酸（碱性AA）的氨基形成肽键BNHS适用标记抗体和中性或偏碱性的蛋白质生物素N-羟基丁二酰胺碳二亚胺生物素羟基琥珀酰亚胺酯(BNHS)如何减小空间位阻长臂活化生物素（BCNHS）：生物素和N-羟基丁二酰亚胺之间添加了两个6-氨基已糖分子基团，形成连结臂，生物素与大分子基团的距离增加，更易发挥生物素的活性作用。生物素分子量小，当与抗体或酶形成生物素标记结合物后，由于大分子蛋白的空间位阻效应，可对生物素与亲和素的结合以及BAS的应用效果造成干扰。标记蛋白质醛基的活化生物素生物素酰肼(BHZ)：水合肼与生物素的合成物主要用于标记偏酸性糖蛋白肼化生物胞素(BCHZ)：生物素与赖氨酸连接后，再与无水肼反应而成。除醛基外，BCHZ还可标记氨基标记蛋白质巯基的活化生物素马来酰亚胺-丙酰-生物胞素（MPB)：能特异地与蛋白质巯基结合的活化生物素标记核酸的活化生物素光生物素(photobiotin)光敏物质侧链上连接的芳香基叠氮物基团,经光照后,变为芳香基硝基苯，可直接与腺嘌呤氨基结合,形成B-核酸探针，用于DNA或RNA的标记。生物素脱氧核苷三磷酸（如Bio-dUTP）作为TTP的结构类似物，可采用缺口移位法（DNaseI和DNA聚合酶I）掺入到双链DNA中。BNHS和BHZ可直接标记核酸，但对碱基配对有影响。目前常用光生物素和生物素化dUTP作为标记核酸的活化生物素。特性：活化生物素通过侧链与蛋白分子连接；一个蛋白分子可被多个生物素标记－多价性（是BAS多级放大作用的物质基础）；BNHS多标记抗体和中性或偏碱性的蛋白质,BHZ则多标记微酸性抗原；抗原、抗体标记后活性不变；可对标记材料（如酶）标记：碱性磷酸酶标记后，活性降低；二、活化生物素标记蛋白质注意事项：选择活化生物素：依抗原或抗体分子所带可标记基团的种类（氨基、醛基或巯基）以及分子的酸碱性；控制生物素：蛋白质比例生物素：IgG用量比(mg/mg)宜为2:1,IgG应用浓度0.5~5μg/ml;生物素1~3个/Ag，3~5个/Ab；使用交联臂减少空间阻力第二节亲合素、链霉亲合素的理化性质与标记亲合素(avidin,AV)和链霉亲合素(streptavidin,SA)是生物素的天然特异性结合物。而且，二者均为大分子蛋白，因此几乎所有用于标记的物质均可以同亲合素（AV）或链酶亲合素（SA）结合。结构四亚基糖蛋白四肽链蛋白无糖基PI10.56结合位色氨酸色氨酸生物素44Ka10151015活性13～15U15～18U亲合素（AV）链霉亲合素(SA)一、理化特性SA表面所带正电荷少，且不含糖基，非特异性结合远低于AV，因此目前以SA标记的酶结合物更为常用。二、亲合素/链霉亲合素的标记•可标记AV/SA的物质：酶、抗原或抗体、铁蛋白、胶体金、125I、异硫氰酸荧光素（FITC）等。•HRP-AV(SA)（酶标记蛋白的直接标记法）：过碘酸钠法、戊二醛法。•ABC/SABC：通过与生物素化酶复合物中的生物素结合，间接地与酶形成结合物。AV(SA)+B-HRP/ALPABC(avidin-biotin-peroxidasecomlplex)/ABAP第三节生物素-亲合素系统(BAS)的特点灵敏度高:生物素标记蛋白具有多价性，且标记后的抗原/抗体生物活性不变，每个亲合素有四个生物素结合部位，可同时以多价形式结合到生物素化大分子衍生物和标志物上，因此，BAS具有多级放大作用，反应的灵敏度高。稳定性高和特异性强：AV/SA与生物素结合的亲和常数比抗原-抗体反应至少高1万倍，二者的结合呈高度专一性和不可逆性，且酸、碱、变性剂、蛋白溶解酶、有机溶剂以及反应试剂的高度稀释均不影响其结合。因此，BAS稳定性高，特异性强。第三节生物素-亲合素系统(BAS)的特点适用性广泛：BAS的多级放大作用，以及既可偶联生物大分子，又可连接标记材料，使BAS不仅用于微量抗原、抗体及受体的定量、定性检测及定位观察研究，亦可制成亲和介质用于上述各类反应体系中反应物的分离、纯化。其他：可制成通用试剂（如生物素化二抗等）；反应试剂可高度稀释，特别是与一抗偶联使用可大幅减少一抗用量，降低实验成本；实验所需时间不长。第四节生物素-亲合素系统的应用生物素与亲合素之间结合的亲合力高、特异性强，各自均可以与各型大小分子结合，以及二者在结合反应时具有的多级放大作用等优越性，使BAS及其相关技术被广泛应用在各种标记免疫分析技术领域中，尤其为标记免疫检测自动化分析做出了极大的贡献。一、生物素-亲合素系统基本类型及原理BAB法：Ag+B·AbAg-Ab·BA/SAAg-Ab·B-A/SAB·EAg-Ab·B-A/SA-B·E特点：以游离A/SA分别连接B-Ab和B-EBA法，也称标记亲合素-生物素法:（labeledavidin-biotin,LAB）Ag+B·AbAg-Ab·BA·E/SA·EAg-Ab·B-A/SA·E特点：以A·E/SA·E代替BAB法中的A/SA，省却了加B·E的步骤3.ABC法⑴A+B·EA-B·E----ABC⑵Ag+B·AbAg-Ab·BABCAg-Ab·B-ABC特点:将BAB法中的A先与B-E结合，制备成复合物ABC,网络了大量酶分子，使该法的检测灵敏度显著提高。BABBAABCBAB与ABC成员相同，反应顺序不同此外，按待检反应体系中所用的是生物素化第一抗体或生物素化第二抗体，BAS分为直接法和间接法。方法反应层次直接法BAAg-(Ab-B)-A*BABAg-(Ab-B)-A-B*ABCAg-(Ab-B)-A-B*C间接法BAAg-Ab1-(Ab2-B)-A*BABAg-Ab1-(Ab2-B)-A-B*ABCAg-Ab1-(Ab2-B)-A-B*CBAS实验方法及反应层次二、生物素-亲合素系统在酶免疫测定中的应用BAS在ELISA中的应用：BAS用于固相化抗原/抗体的制备AV/SA先包被固相载体、抗原/抗体先与生物素结合AV/SA-B反应而使抗原/抗体固相化。BAS用于ELISA的终反应放大BA-ELISA、BAB-ELISA、ABC-ELISABAS在均相酶免疫测定中的应用：B·E*AA-B·E（酶因活性中心受空间位阻作用而失活）反应系统：B·E*、Ag·A、Ab（限量）、标准Ag/待检AgAg·A和待检Ag竞争结合限量Ab，若AgAg·AbAg·AAg·A-B·E酶活性变化与待测标本中抗原浓度呈负剂量相关。（酶活性降低）三、生物素-亲合素系统在荧光免疫技术中的应用BAS用于荧光抗体技术可明显提高方法的灵敏度和特异性，通常采用BA法，即用荧光素直接标记亲合素（或链酶亲合素）；也可采用游离亲合素（或链酶亲合素）搭桥，两端分别连接生物素化抗体和荧光素标记的生物素（BAB法）或荧光标记的抗亲合素（或链酶亲合素）抗体的夹心法。BAS用于时间分辨荧光免疫分析也可以将反应信号放大。四、生物素-亲合素系统在放射免疫测定中的应用BAS主要与免疫放射分析(IRMA)检测体系偶联，用于对终反应的放大（BA法）BAS也可用于IRMA反应后B、F成分的分离五、生物素-亲合素系统在分子生物学中的应用以生物素标记核酸探针进行的定位检测用BAS制备的亲和吸附剂进行基因的分离纯化将免疫测定技术与PCR结合建立免疫-PCR(immuno-PCR)用于抗原的检测如DNA·B-SA·ProA-IgG-Ag,Ag和DNA间建立对应关系，从而将对蛋白质的检测转化为对核酸的检测，抗原抗体反应的特异性与PCR技术的高度敏感性相结合，其检测灵敏度可达10-21mol水平，是迄今最敏感的分析方法。思考题1.生物素的分子结构特点是什么？2.生物素通过什么结构、形式与生物大分子相连结？3.亲合素或链霉亲合素的分子结构、理化性质有何特点？4.为什么亲合素、链霉亲合素具有“桥联”作用？5.亲合素、链霉亲合素可以被哪些示踪剂标记？6.为什么生物素－亲合素系统具有放大作用？7.生物素与亲合素或链霉亲合素的结合是否与抗原抗体结合相同？8.生物素－亲合素系统放大的是反应过程还是单一检测信号？9.生物素、亲合素或链霉亲合素如何与标记免疫技术联接？10.如何将生物素－链霉亲合素放大系统用于所有双位点ELISA?小结•生物素—亲合素（链霉亲合素）系统具有的多级放大独特效应，可极大地提高分析测定的灵敏度；二者之间的高亲和、高特异结合以及既可偶联生物大分子，又可连接标记材料的特性，使该系统在标记免疫分析技术领域中的应用具有很强的稳定性和适用性。该系统有二种基本类型：以游离亲合素为中间物，分别连接包含生物素化大分子的待检反应体系和标记生物素的BAB法或ABC技术；另一类是直接用标记亲合素连接生物素化大分子反应体系进行检测的BA法或LAB。此外，按生物素化第一抗体或生物素化第二抗体，又分为直接法或间接法BAS系统。•在生物素—亲合素（链霉亲合素）放大系统应用中，无论采用酶、荧光素或发光物作为检测示踪剂，均是待测抗原与生物素化抗体反应形成复合物后，再利用生物素与亲合素间的多价放大结合特性，或直接与标有示踪剂的生物素结合（BA、LAB法），或依次与亲合素（链霉亲合素）、生物素示踪标记物反应连接成聚合物（BAB、ABC法），最终使待测反应信号被放大，提高检测方法的灵敏度。