(2013-5-22)酶化学B

第10章酶的作用机制和酶的调节一酶的活性中心（一）、活性中心(activesite)的概念活性中心：活性中心：酶分子中直接与底物结合并催化底物发生化学反应的部位。活性中心分为结合部位和催化部位结合部位：负责与底物的结合，决定酶的专一性（与km有关）。催化部位：负责催化底物键的断裂形成新键，决定酶的催化能力效率（kcat)和催化性质。结合部位和催化部位也可以合二为一，活性部位可以提供调节部位，也可以为活性部位提供物质基础酶的活性中心（二）、活性中心的结构特点：1．活性部位在酶分子中只占一小部分（1％～2％）2．酶活性部位是一个三维的特定空间结构3．酶的活性部位和底物有时不互补-诱导契合4.酶活性部位位于酶分子表面的一个裂缝内，裂缝内往往是个疏水的微环境。5．底物通过次级键结合到酶上，形成ES复合物。6．酶活性部位是柔性或可运动性，即酶与底物结合时构象发生一定的变化才互补。频率最高的活性中心的氨基酸残基：Ser、His、Cys、Tyr、Asp、Glu、Lys。酶与底物结合成ES复合物主要靠次级键：氢键、盐键、范德华力和疏水相互作用。----底物可以稳定酶！酶的活性中心（三）、研究活性中心的方法化学修饰法通常是比较在底物或竞争性抑制试剂是否存在的情况下的化学修饰1、酶分子侧链集团的共价修饰（化学修饰）法酶的化学修饰法分类（1）、非特异性共价修饰某些酶活性中心含有的活性基团在活性中心以外不存在或很少，这时可选择某些非特异性试剂进行修饰（2）、特异性共价修饰如DFP（二异丙基氟磷酸）可与活性中心中的丝氨酸反应。如，DFP与胰凝乳蛋白酶作用（只和活性部位的丝氨酸残基的羟基结合）（3）.亲和标记法亲和标记（Affinitylabeling）：也属于共价修饰，主要是利用酶与底物特异性结合的原理而发展起来的一种特异性化学修饰法。（TPCK）修饰a－胰凝乳蛋白酶His57何谓亲和层析？Ks型不可逆抑制剂又称(?)研究活性中心的方法(续)2、动力学参数测定法活性部位氨基酸残基(解离状态)和(酶活性)直接相关通过动力学方法求有关参数，对酶活性部位化学性质作出判断。通过研究酶活性与pH关系，可以推测到与催化直接相关的某些基团的pK值，进而推测这些基团的作用研究活性中心的方法(动力学分析法)核糖核酸酶最适PH=7.8参照最适PH值：谷氨酸、组氨酸或赖氨酸哪一个可能在活性中心？胃蛋白酶的最适PH值为2，哪一类氨基酸可能在活性中心？研究活性中心的方法(动力学分析法)酶最适pH活性中心的氨基酸胃蛋白酶1.8Asp215和Asp32胰蛋白酶7.7His57,Asp102,Ser195核糖核酸酶7.8His12,His119,溶菌酶5.2Asp52,Glu35研究活性中心的方法(续)4、定点诱变通过改变基因来改变蛋白质的结构，制造新的蛋白质。3、X－射线衍射分析法通常是将酶与底物类似物或专一性抑制剂形成复合物，而后作X－射线衍射分析。例如：(溶菌酶活性中心）定点诱变天冬酰胺后Kcat小了5000倍结论：？苯丙氨酸后Kcat不变Km提高了6倍结论：？胰蛋白酶突变突变羧肽酶A为验证羧肽酶ATyr248在催化中的作用，对其基因进行定点突变－Tyr248（TAT）定点突变为Phe（TTT）；实验结论是，Tyr248参与了与底物的结合，但不是催化所必须的，此结论必定来自如下数据：A.Kcat突变后降低B.Km变大C.Kcat/Km升高D.Kcat不变E.Kcat/Km降低上海交通大学2007生物化学定点诱变突变为苯丙氨酸后：Kcat不变，Km提高了6倍（四）、酶的必需基团（自学）必需基团：酶分子中与催化作用直接相关、不可缺少的化学基团。（1）、活性中心内的必需基团：结合基团：与底物结合，形成酶－底物复合物的部位；催化基团：影响底物中化学键的稳定性，与底物发生化学反应，将底物变成产物。（2）、活性中心外的必需基团（调控基团或维持酶活性）构成酶活性中心的基团：His的咪唑基、Ser的-OH、Cys的-SH、Glu的-羧基1.酶的必需基团是（）（1）必需基团构成具有一定空间结构的构象（2）和底物结合幷将之转化成产物的部位（3）抑制剂都作用于酶的活性中心（4）所有酶的活性中心都有金属离子2.酶的活性中心是（）（1）所有的酶都有活性中心（2）所有活性中心都有辅基（3）酶的必需基团都位于活性中心（4）变构抑制剂直接结合的部位（5）重金属沉淀酶的结合区域3.讨论酶活性中心的特点，指出两种常用于研究酶活性中心的方法(8分)（大连理工大学、中国农业大学2011生物化学）思考题思考题5.用定位点突变方法得到缺失某一个氨基酸残基突变体，这个突变的酶蛋白不再具有催化活性，因此可以认为该缺失残基一定是酶结合底物的必需基团。（判断）华南理工大学20096.某同源蛋白中的Ala残基被替换为Val，此类替换属于保守性替换。中山大学20097．在酶的结构上十分重要，但在催化过程中极不可能和底物相互作用，它是()a.谷氨酸b.胱氨酸c.组氨酸d.酪氨酸e.丝氨酸江南大学2007思考题8.什么是酶活性中心？有一种酶，含一个半胱氨酸残基，设计一个技术线路，验证该Aa是否参与酶的催化作用或专一性。中国农业大学2010生物化学碘乙酸（碘乙酰胺）9名词解释：酶的活性部位2013年山东大学10、判断：酶的活性中心由一级结构上相邻的氨基酸残基构成2013年江南大学华东师范大学2008年酶高效性的机理1、底物和酶的邻近效应与定向效应2、底物的形变与诱导契合3、酸碱催化4、共价催化5、活性中心金属离子6、活性部位微环境的影响二、影响酶催化效率的有关因素3版生物化学酶促反应的机制（一）、基元催化的分子机制：基元催化：由某些集团或小分子催化的反应，如1、酸碱催化2、共价催化3、活性中心金属离子（二）、酶具有高催化能力的原因1、底物和酶的邻近效应与定向效应2、底物的形变与诱导契合3、多元催化与电荷极化4、活性部位微环境的影响新版生物化学填空:一个是酶的特殊基团的催化作用是指酸碱催化、共价催化和()中山大学2010年（二）、酶具有高催化能力的原因1.邻近效应与定向效应Proximity/Orientation底物与酶的邻近效应与定向效应邻近效应与定向效应变分子间反应为分子内反应。邻近效应：酶与底物形成中间复合物后使底物之间、酶的催化基团与底物之间相互靠近，提高了反应基团的有效浓度。定向效应：由于酶的构象作用，底物的反应基团之间、酶与底物的反应基团之间正确取向的效应。酶把底物分子从溶液中富集出来，使它们固定在活性中心附近，反应基团相互邻近，同时使反应基团的分子轨道以正确方位相互交叠，反应易于发生。邻近与定向（轨道定向）效应A.反应物的反应基团和催化基团既不靠近，也不彼此定向B.两个基团靠近，但不定向，也不利于反应C.两个基团既靠近，又定向，大大有利于底物形成过渡态，加速反应酶中某些基团可使底物分子的敏感键中某些基团的电子云密度变化，产生电子张力，降低了底物的活化能①、酶从低活性形式转变为高活性形式，利于催化。②、底物形变，利于形成ES复合物。③、底物构象变化，过度态结构，大大降低活化能（二）、底物形变和诱导契合的催化效应溶菌酶底物形变：酶与底物结合后，D糖环构象发生变形，从正常的能量较低的椅式构象变为能量较高的半椅式构象。1、定义：酶分子的一些功能基团起瞬时质子供体或质子受体的作用，降低了活化能加速了反应，这种机制称为...。Specificacid-basecatalysis（H+或OH-)Generalacid-basecatalysis（H+或OH-)+供体2、分类（三）、酸碱催化酶酶Manyproteinenzymesusegeneralacid-basecatalysisasawaytoincreasereactionrates（催化有机反应的最普遍有效的催化剂）Acid-BaseCatalysisSpecificacid–basecatalysisGeneralacid-basecatalysisTheactivesiteofsomeenzymescontainaminoacidfunctionalgroup,suchasthoseshownhere,canparticipateinacid-basecatalysispKavalue*Asp3.9;Glu4.1Lys10.5;Arg12.58.36.013.010.5Sidechainsusedingeneralacid-basecatalysisTheactivesiteofsomeenzymescontainaminoacidfunctionalgroup,suchasthoseshownhere,canparticipateinacid-basecatalysispKavalue*PH=7-COOHAsp3.9;Glu4.1COO--NH3+Lys10.5;Arg12.5NH3+组氨酸-6.0Sidechainsusedingeneralacid-basecatalysis思考题例如：某酶的化学修饰实验表明，Glu和Lys残基是这个酶活性所必需的两个残基。根据pH对酶活性影响研究揭示，该酶的最大催化活性的pH近中性。请你说明这个酶的活性部位的Glu和Lys残基在酶促反应中的作用，并予以解释[答]谷氨酸的ā-羧基的pKa值约为4.0，在近中性条件下，该基团去质子化，在酶促反应中起着碱催化剂的作用。赖氨酸的?-氨基的pKa值约为10.0，在近中性条件下，它被质子化，在酶促反应中起着酸催化剂的作用。3、影响酸碱催化反应速度的两个因素⑴酸碱强度(pK值）。组氨酸咪唑基的解离常数为6，在pH6附近给出质子和结合质子能力相同，是最活泼的催化基团。⑵给出质子或结合质子的速度。咪唑基最快，半寿期小于10-10秒酸碱催化所以，His是酶中最有效最活泼的一个催化功能基团。思考题1.在酶的广义酸碱催化机制中，特别重要的一个氨基酸残基是____，其侧链pK值接近生物体的pH值。中山大学2007年2.蛋白酶的酸碱催化作用加强了共价键化基团对肽键碳原子的亲核进攻能力。（是非题）中山大学2009年3.名词解释：酸碱催化华东师范大学2003年思考题4.在生理条件下，下列哪种既可以作为H+的受体，也可以作为H+的供体?（A）His的咪唑基（B）Lys的ε氨基（C）Arg的胍基（D）Cys的巯基（E）Trp的吲哚基华东师范大学2007年NucleotidesH2O2`或3`-核苷酸核苷2`,3`环磷酸酯BasichydrolysisofRNADuetothe2’-hydroxyl(1).共价催化：酶作为亲核基团或亲电基团，与底物形成一个反应活性很高的共价中间物，此中间物易变成过渡态，反应活化能大大降低，提高反应速度。（四）共价催化Covalentcatalysis酶底物共价键（2）.共价催化分类①（酶中）亲核基团：（亲核催化）Ser的羟基、Cys的硫基，His的咪唑基、Asp的羧基，等；这些富含电子的基团(有孤对电子)，攻击底物分子中电子云密度较小的亲电子基团（底物中常见的亲电集团：如磷酰基、酰基和糖基），并供出电子，二者形成共价键，酶和底物形成一个不稳定的中间物，进而转变为产物。②（酶中）亲电子基团：（亲电催化）H+、Mg2+、Mn2+、Fe3+某些辅酶，如焦磷酸硫胺素和磷酸吡哆醛等也可以参与共价催化作用。共价催化集团共价催化举例-胰凝乳蛋白酶1.亲核催化中酶蛋白上最常见的提供亲核基团的残基是（）A，His，Ser，Cys；B，His，Lys，Arg；C，Asp，Glu，PheD，Asn，Gln，Trp中国科学院2005年共价催化举例-胰凝乳蛋白酶2.酶蛋白氨基酸侧链提供各种亲核中心，可以对底物进行共价催化，酶蛋白上最常见的3种亲核基团为：(),()，()。底物的亲电中心主要有：（至少写出2种）。中国科学技术大学2007-2008学年第I学期生物化学（区分）可逆的共价修饰的调控（1）共价修饰调节：酶蛋白分子中的某些基团可以在其他酶的催化下发生可逆的共价修饰,从而导致酶活性的改变,称