NK细胞毒活性

免疫学实验·1·NK细胞毒检测张海红周艳E-mail：[e-mail]-mail：[e-mail]免疫学实验·2·实验分组及材料实验原理检测方法主要操作步骤结果判定主要内容免疫学实验·3·器材1.75%酒精若干2.无菌纱网1块/组3.无菌平皿1块/组4.无菌吸头（大、中、小）3盒/room5.无菌96孔培养板1块/组6.可调微量加样器1套/组7.细胞计数板1套/组8.显微镜1台/组9.EP管若干10.眼科剪、小镊子1套/组11.细胞培养箱1台/room12.酶标仪1台13.离心机2个/room14.超净台1台/组动物、细胞及试剂1.小鼠1只/组(NS,OVA)2.YAC-11*106*2ml3.培养液（DMEM)无FCS4ml/组4.培养液(DMEM)10%FCS10ml/组3.LDH底物3ml/组4.柠檬酸（终止液）1ml/组分组：每组4人1只小鼠实验分组及材料免疫学实验·4·NK（naturalkiller）细胞属非特异性免疫细胞，为机体的天然免疫系统中主要的效应细胞，是与T、B细胞并列的第三类群淋巴细胞。NK细胞可非特异直接杀伤靶细胞，这种天然杀伤活性既不需要预先由抗原致敏，也不需要抗体参与，且无MHC限制。YAC-1细胞为Moloney鼠科白血病毒(Mo-MuLV)感染的鼠T淋巴瘤细胞，对NK细胞敏感，可用于检测NK细胞的杀伤活性。原理免疫学实验·5·密度梯度离心Ficoll密度梯度离心Percoll密度梯度离心磁化细胞分离器分离法NK细胞分离方法免疫学实验·6·同位素释放法：51Cr、3H-TdR、125I-UdR乳酸脱氢酶释放法(本次实验采用)常用的检测方法免疫学实验·7·G0G1SNa251CrO4、3H-TdR、125I-UdRNewDNAOrProteincpm均值均值－自然释放孔最大释放孔均值均值－自然释放孔试验孔cpmcpmcpmcpmSI同位素释放法免疫学实验·8·应用放射性同位素（如51Cr）标记靶细胞，当靶细胞受到NK细胞攻击，靶细胞被破坏，释放出51Cr。51Cr辐射γ射线，通过测定受损伤或死亡靶细胞释放到上清中51Cr的放射脉冲数（cpm)，即可计算出NK细胞活性。同位素释放法免疫学实验·9·乳酸脱氢酶(LDH)存在于细胞内，正常情况下，不能透过细胞膜。当细胞受到损伤时，LDH可从细胞内释放至培养液中。释放出来的LDH在催化乳酸生成丙酮酸的过程中，使氧化型辅酶I(NAD+)变成还原型辅酶(NADH)，后者再通过递氢体-吩嗪二甲酯硫酸盐(PMS)还原碘硝基氯化氮唑蓝(INT)或硝基氯化四氮唑蓝(NBT)形成有色的甲基化合物，在570nm波长处有一吸收峰，利用读取的Ａ值，可测得杀伤细胞毒活性。乳酸脱氢酶释放法-原理免疫学实验·10·靶细胞YAC-1NK杀伤LDH释放到细胞外无色底物LDH底物还原有色物质测OD570值乳酸脱氢酶释放法靶细胞膜损伤最大释放均值（Max）=最大释放孔cpm均值-最大释放对照孔cpm均值自发释放均值（S自发）=自发释放孔cpm均值-培养基对照孔cpm均值杀伤率(%)=Max-S自发实验值-自发释放值×100免疫学实验·11·操作流程1W无菌取脾研磨成单细胞悬液+2ml1640（无FBS)细胞计数【?/ml】取20ul细胞+980ul的1640混匀后取出20ul细胞+20ul台盼蓝加板(三复孔)(加法见附图)调细胞浓度1×107/ml5%CO237℃培养2小时离心，取100ul上清移入新孔，37℃孵育10min加入底物100ul/well室温避光孵育15min30l/孔1mol/L柠檬酸酶标仪测吸光度值：OD570nm结果判定：培养YAC－1细胞＋10%FBS1640培养液调细胞浓度1×106/ml免疫学实验·12·单细胞悬液的制备1.小鼠脱臼处死，用酒精棉球擦试皮毛消毒。2.于超净台内取出脾组织，放入预先盛有2ml1640培养液的平皿内。3.用纱网将脾组织包裹住，用直头镊子固定组织，用弯头镊子轻压组织，将其捣碎。然后用1000ul加样器隔着纱网将细胞悬液吸出，放入50ml离心管中，用剩余2ml培养液冲洗，将细胞悬液吸出，也放入同一50ml离心管中。4.1000rpm，常温离心10分钟，弃上清，加1ml1640培养液重悬细胞。细胞计数：1.取上述制备好的细胞悬液混匀后取出20ul，加到盛有980ul计数液的EP管中，混匀后取出20ul到一个新的EP管中，再向其中加入20ul台盼蓝染料，混匀后取20ul计入到细胞计数版上，在显微镜下计数，计数方法见后。2.调脾细胞浓度至1×107/ml，每组所需总量为1ml3.调YAC－1细胞浓度至1×106/ml，每组需2ml注意:在稀释前一定将原细胞悬液混匀，否则细胞长时间沉淀使细胞数不准。实验步骤免疫学实验·13·细胞培养：1.按图所示加板。2.将板做好标记，在倒置显微镜下观察细胞，然后放于37℃5%CO2培养箱中，培养2小时。LDH底物：1.在培养2小后，1000rpm，离心5min，取100ul上清液移入新孔内，于每孔内加入LDH底物100ul，加完后轻轻搕板，使之混匀。2.室温避光保存15min。3.取出，加入1mol/L柠檬酸，30l/孔。酶标仪读数前保证没有气泡。结果测定：1.结果测量：用酶标仪测定光密度值：OD570nm。记录结果。2.结果判定：Max（靶细胞最大释放）=最大释放孔均值-最大释放对照孔均值S自发（靶细胞自发释放）=自发释放孔均值-培养基对照孔均值注：S自发＜0，做“0”处理实验步骤SI=Max-S自发实验孔值-自然释放孔值×100%免疫学实验·14·1-34-67-910-12A自然释放孔100ulYAC-1cells+100ul10%1640B(E:T=100:1）100ulYAC-1cells+100ulspleenCellsC(E:T=50:1）100ulYAC-1cells+50ulspleenCells+50ul10%1640D(E:T=25:1）100ulYAC-1cells+25ulspleenCells+75ul10%1640E最大释放孔100ulYAC-1cells+100ul1%NP-40F最大释放对照孔100ul1%NP-40+100ul10%1640G培养基对照孔200ul10%1640Max=E-FS自发=A-G加板方法Max-S自发B,C,DA实验孔值-自然释放孔值×100%SI=免疫学实验·15·结果处理算出不同E:T时的SI值，用Excel作图，横坐标为E:T,纵坐标为SI值。把用酶标仪读出的原始数据（每人一份）和用Excel作的图一起贴到实验记录本上。要对结果进行分析，写出影响结果的因素，及注意事项。免疫学实验·16·NK杀伤实验01020304050100:150:125:1E：TSIExcel作图