第二章现代微生物生态学

第二章现代微生物生态学现代生态学的研究领域现代生态学要回答和解决的主要问题微生物生态系统多样性微生物生态学研究方法传统方法分子生物学方法微生物酶活性测定1现代生态学的研究领域生态系统中种群规模的调控生物生产力的利用和保护研究人工生物群落的稳定性和提高生产力环境污染防治城市生态系统生态学和人类生态学的研究和建设2现代生态学要研究与解决的主要问题能源短缺问题环境污染问题防止自然生态系统的萎缩、保护森林，防止沙漠化等城市有机废弃物的处理及综合利用的生态工程建立高产高效、持续发展的生态农业和企业化生态工厂。如：白色农业生命活动密切相关元素、化合物及生态效应与人体健康关系。海洋资源的生态调查、开发利用、保护的研究3微生物生态系统多样性陆生微生物生态系统水生微生物生态系统大气微生物生态系统根系微生物生态系统肠道(消化道)微生物生态系统极端环境微生物生态系统活性污泥微生物生态系统“生物膜”微生物生态系统海洋古菌的分布海洋真细菌的分布海洋真菌的分布海洋真核微藻的分布海洋病毒的分布海洋微生物的分布海洋古菌的分布古菌的绝对数量大约占微型浮游生物的2%。表层海水中多为广域古菌，而在150米深以下的水域中则以泉古菌为主。浮游古菌的分布还受到季节、海水温度和海流等环境因素影响。不同海域、不同深度的沉积物中古菌分布不均。同一海域沉积物中，影响古菌分布的主要因素是有机物。海底火山口主要分布为泉古菌，少量为广古菌。海底热泉口主要分布嗜热古菌（典型类群为热网菌属Pyrodictium和火叶菌属Pyrolobus）。海洋浮游古菌沉积物中古菌特殊生境古菌大多数古菌难以分离培养，主要利用分子生物学技术进行多样性研究。近几年在沿岸水域发现海洋古菌群Ⅰ和海洋古菌群Ⅱ，在不透光层以下海域发现海洋古菌群Ⅲ，在深海海水中发现海洋古菌群Ⅳ。泉古菌目广古菌目ThemarinespongeAxinellamexicanaanditsarchaealsymbiont,Cenarchaeumsymbiosum.3A.,AxinellamexicanaabrightreddemospongefoundofftheCaliforniacoast.3C.,FISHexperimentshowingC.symbiosumpopulationpresentinthespongetissues(ingreen).ManyoftheC.symbiosumcellsarevisiblydividing.海洋真细菌的分布•海洋浮游细菌分布受可利用有机物、季节、深度、盐度、及叶绿素浓度影响较大而区域性差异影响较小。•沉积物中的海洋细菌分布表现区带化特征。海洋浮游细菌主要属于α-变形菌纲、γ-变形菌、拟杆菌纲等。海底沉积物中酸杆菌门、α-变形菌纲、γ-变形菌、δ-变形菌纲、拟杆菌纲等多种类型菌种。近年来，不断有从海洋中新类群的发现。海洋细菌海洋真细菌的分布浮游放线菌是海洋放线菌的重要组成部分，数量处于中等丰度水平，相关报道较少。海洋沉积物中最重要的真细细类群。其中浅海区以链霉菌为主，也有较多游动放线菌；而深海区沉积物中的优势放线菌为小孢囊菌和诺卡氏菌。无脊椎动物及海洋植物的表面或体内存在着相当部分的海洋放细线菌，研究得较多的是海绵。海洋放线菌海洋真细菌的分布迄今为止发现的海洋蓝细菌主要属于原绿球藻属（Prochlorococcus）和聚球藻属（Synechococcus）。是海洋初级生产者的重要组成•聚球菌分布于热带和温带海域。粒径为0.5-1.5um。通常比其消费者微型原生动物至少高一个数量级，足以作为微型原生动物的重要食物源。对总初级生产力的贡献在世界大多数海区为20-60％•原绿球菌(Prochlorococcus)分布广泛。粒径为0.4-0.8um。丰度大于聚球菌，对总初级生产力的贡献约为50%海洋蓝细菌海洋真菌的分布木生真菌藻体真菌红树林真菌海草真菌寄生动物体真菌海底沉积物真菌存在于漂流木、沉积木。多数为子囊菌。其分布特点为热带海域和浅海较广泛。种类与丰度受季节及附着基质影响。生活方式为腐生、寄生或共生。海藻及其代谢物对其分布影响显著。如含单宁酸的马尾藻真菌极少；红藻上有数量较多的酵母菌而褐藻相对较少，因后者分泌酚类。多数为腐生，能分解红树的枯枝败叶，为海洋提供有机物碎片。多栖于海草的叶部和根部，数量少。寄生于动物的外骨骼及肠道等。发现不同海域沉积物中都有真菌，但鉴定的很少。海洋真核微藻的分布寒带种：最适温度小于4℃。小于0℃左右为寒带种；0℃-4℃来亚寒带种。温带种：最适温度4℃-20℃。4℃-12℃为冷温带种12℃-20℃为暖温带种。热带种：最适温度大于20℃。20℃-25℃为亚热带种；大于25℃为热带种。主要影响因子为光强。分喜光藻与适阴藻。海底的分布与沉积物的组成及大小相关，含沙粒的多于泥泞。双峰模式：温带海域春、秋各有一个高峰（受光强、营养盐影响）。单峰模式：寒带海域春季一高峰；某些温带海域（受径流影响）。水平模式：多见热带海域（季节不明显）水平分布垂直分布季节变化海洋病毒的分布季节、水深、光密度、温度、盐度等理化因子影响海洋浮游病毒的分布。赤潮发生期病毒丰度骤增。丰度随宿主变化而变化。病毒丰度与宿主丰度间的比值（virus-to-bacteriumratio,VBR）是研究病毒侵染对水生菌群影响的重要参数。•底栖病毒丰度大于浮游病毒丰度。•VBR也大于浮游病毒•沉积层深度增加病毒丰度及VBR都降低。浮游病毒底栖病毒4.1微生物生态学研究中的传统方法样品的采集微生物菌量计数富集培养和菌种分离最大或然值法活菌计数法4.2微生物生态学研究中的分子生物学方法核酸探针杂交技术PCR特异性扩增技术rRNA基因同源性分析方法核酸探针杂交技术•核酸杂交技术快速，能灵敏地探测出环境微生物中特殊的核酸序列，并且用光密度测定法可直接比较核酸杂交所得到的阳性条带或斑点就能得出定量的结果，从而反映出相关微生物的存在及功能。•标记核苷酸探针可直接用来探测溶液中、固定在膜上或细胞或组织内的同源核酸序列。探针可以是长探针(100-1000bp)，也可以是短的寡核苷酸(10-50bp)。杂交方式可以是菌落杂交、狭缝杂交或原位杂交。菌落杂交该法可从大量细菌中筛选含特异的DNA序列及基因工程重组体。杂交探针不仅可以鉴定细菌克隆也可以鉴定噬菌体形成的噬菌斑。首先将克隆或噬菌斑转移到纤维素膜或尼龙膜上，去掉所有的残留物，只留下DNA，这种处理同时导致了DNA变性，使双链的氢键断裂形成单链分子。通过80℃短时间处理，将DNA分子固定在膜上（纤维素膜）；对于尼龙膜需要进行紫外交联，通过糖-磷酸中枢将分子连接到膜上。标记探针，加热变性，加入到杂交膜上进行杂交，然后洗去未结合的探针，干燥，接合探针的位置就可以检测出来。斑点杂交或狭缝杂交法基本过程：将变性的DNA或RNA直接点到固相支持滤膜上→用标记探针与之杂交→自显影或显色反应→检测杂交信号→分析结果。优点：简便、快速、灵敏、样本用量少；缺点：特异性不高，有一定比例的假阳性。用途：检测样本中存在的微量DNA或RNA原位杂交将标记探针与细胞或组织切片中的核酸进行杂交，进而检测特异的DNA或RNA序列。细胞原位杂交组织切片原位杂交DNA-DNARNA-DNA三类杂交RNA-RNA该法优点：不需提取核酸，故可完整保持组织或细胞的形态，因而更能准确地反映组织细胞的功能状态。有PCR特异性扩增技术•在环境检测中，靶核酸序列往往存在于一个复杂的混合物中，且含量极低，若探测这种复杂群体中特异微生物或某个基因，杂交就显得不敏感。•PCR技术使靶序列放大几个数量级，再用探针杂交探测对被扩增序列作定性或定量研究分析微生物群体结构。PCR常与其他技术结合起来使用，如RT-PCR，competitivePCR、nestedPCR、RAPD、ARDRA等。第一步：第一对引物结合。第一对引物也可能结合到其他具有相似结合位点的片段上并扩增多种产物。第二步：第二套引物对第一轮PCR扩增的产物进行第二轮PCR扩增。由于第二套引物位于第一轮PCR产物内部，而非目的片断包含两套引物结合位点的可能性极小，因此第二套引物不可能扩增非目的片断。NestedPCRcompetitivePCR是一种定量PCR（quantitativePCR），通过向PCR体系中加入人工构建的带有突变的竞争模板、控制竞争模板的浓度来确定目的模板的浓度，对目的模板作定量研究。靶基因与参考标准在同一反应管中共同扩增，但参照标准通常是一段人工合成的模板而不是内源性基因。竞争PCR必须构建一个内部标准，此标准能与靶基因竞争聚合酶、核苷酸和引物分子，具有相同的引物结合位点，其扩增产物能通过电泳或高效液相色谱(HPLC)等方法区分开来。对竞争性模板作系列稀释后加入到恒量的样品DNA中进行PCR，靶基因的量取决于所添加的竞争性DNA片段的量，使两者的PCR终产物有相等摩尔数。competitivePCR用那些对某一特定基因的非特异性的引物来扩增某些片段。RAPD分析用于探测含有混合微生物种群的各种生物反应器中的微生物多样性。其分析得到的基因组指纹图谱在比较一段时间内微生物种群的变化以及比较小试规模和中试规模的反应器方面是有用的。但不足以用来估测群落的微生物多样性。RAPD(randomlyamplifiedpolymorphicDNA)rRNA基因分析方法•rRNAapproach是综合应用多项分子生物技术对细胞中rRNA基因进行分析，从而揭示微生物多样性。•所使用的技术主要包括环境样品中DNA的提取、引物及探针的设计、PCR扩增、梯度胶电泳（主要是DGGE和TGGE）、限制性内切酶长度多态型（RFLP）、基因文库的筛选、序列测定、序列分析及系统进化树构建、斑点杂交和全细胞原位杂交及巢式杂交等。微生物样品基因组DNA的提取16srRNA基因片段的获得（pcr）16srRNA基因片段的分析16srRNA基因分析步骤肠道微生物样品基因组DNA的提取rRNA的含量很高，易于获得较多的模板，但是RNA易降解，因此一般研究多采用提取细胞总DNA。肠道环境中存在的细菌种类繁多，形态及性质各异，必须尽可能无选择性地裂解肠道细菌细胞以得到代表性的核酸分子。菌体细胞裂解常用方法•酶法•化学法•机械法目前认为最可靠的方法是：溶菌酶配合微珠振荡裂解，使肠道混合微生物的DNA充分释放，再用酚-氯仿抽提总DNA。16srRNA基因片段的获得16SrRNA通用引物进行PCR扩增的一般程序94~96℃预变性2~5min94~95℃变性30~60s45~55℃退火60s68~72℃延伸2~4min最后68~72℃延伸6~10min缺点：可能出现嵌合产物和扩增偏嗜性现象。16srRNA基因片段的分析1）将PCR产物克隆到质粒载体上进行测序，与16SrRNA数据库中序列比较，确定其进化树中位置，从而鉴定样品中可能存在的微生物种类。16SrRNA基因片段的分析方法特点：该方法获得信息最全面，但在样品复杂情况下测序工作繁重。主要应用：单株菌的鉴定；两种菌的同源性比较，确定其归属。2）16SrRNA基因片段的多态性分析（又叫DNA遗传指纹图谱技术）。经PCR后其产物为序列等长但不同源的DNA混合物，常用DGGE、TGGE等手段分离。混合物中序列的多样性和不同序列的丰度在一定程度上反映原始样品中微生物种群的多样性和不同物种的丰度。特点：PCR过程中的碱基插入等造成错误主要应用：微生物群体多样性；微生物种群动态分析等。3）通过16SrRNA种属特异性的探针与PCR产物杂交以获得微生物组成信息。此外，探针也可以直接与样品进行原位杂交，通过原位杂交不仅可以测定微生物丰度，且能分析它们的空间分布16SrRNA基因片段的分析方法特点：简单快速。主要应用：快速验证其它方法可能出现的假阴阳性；混合物中钓取已知特定种类。4）对PCR产物进行RFLP或T-RFLP。将PCR产物酶切，通过观察酶切电