第七章诱变育种

第七章诱变育种第一节诱变育种的作用和特点第二节诱变育种前的准备工作第三节诱变第四节筛选第五节常见突变株的筛选花菇带图象分析系统的微生物菌种显微观察装置工业菌种的育种方针工业菌种的育种：是运用遗传学原理和技术对某个用于特定生物技术目的的菌株进行的多方位的改造。通过改造，可使现存的优良性状强化，或去除不良性质或增加新的性状。工业菌种育种的方法诱变基因转移基因重组育种过程包括下列3个步骤：(1)在不影响菌种活力的前提下，有益基因型的引入。(2)希望基因型的选出。(3)改良菌种的评价(包括实验规模和工业生产规模)。选择育种方法时综合考虑的因素(1)待改良性状的本质及与发酵工艺的关系(如批式或连续发酵试验)；(2)对这一特定菌种的遗传和生物化学方面认识的明了程度；(3)经济费用。如果对特定菌种的基本性状及其工艺知晓甚少，则多半采用随机诱变、筛选及选育等技术：如果对其遗传及生物化学方面的性状已有较深的认识，则可选择基因重组等手段进行定向育种。工业菌种改良方法(1)解除或绕过代谢途径中的限速步骤：通过增加特定基因的拷贝数或增加相应基因的表达能力来提高限速酶的含量；在代谢途径中引伸出新的代谢步骤，由此提供一个旁路代谢途径。(2)增加前体物的浓度。(3)改变代谢途径，减少无用副产品的生成以及提高菌种对高浓度的有潜在毒性的底物、前体或产品的耐受力。(4)抑制或消除产品分解酶。(5)改进菌种外泌产品的能力。(6)消除代谢产品的反馈抑制。如诱导代谢产品的结构类似物抗性。提高特定基因的表达水平(1)引入强转录及翻译信号，可通过在一高效表达载体上克隆靶基因；在靶基因的上游引入强启动子；修改现有表达信号，提高基因效力等。(2)诱导解除基因表达抑制的突变。改进菌种的生长效率提高菌株对底物的利用率方法：(1)通过确定并改变代谢中的耗能部分;(2)由另一菌株的高效低能代谢途径代谢来实现。(3)赋予菌种对多种底物，特别是价廉而丰富的底物的利用能力，由此可降低操作费用。第一节诱变育种的作用和特点微生物诱变育种是用人工诱变方法诱发微生物基因突变，通过随机筛选，从多种多样的突变体中筛选出产量高、性能优良的突变体，并找出突变体的最佳培养基和培养条件，使突变体在最适环境条件下大量合成目的产物。因此，诱变、筛选和改变环境因素是诱变育种的三个重要环节，三者相辅相成，缺一不可。生产选种的局限性：以微生物的自然变异作为基础的生产选种的机率并不很高，一个基因的自然突变频率仅10-6-10-10左右。诱变育种：以诱发突变为基础的育种，是迄今为止国内外提高菌种产量、性能的主要手段。诱变物理、化学或生物诱变方法一、诱变育种的作用诱变育种的作用主要有以下几个方面：1.提高有效产物的产量：通过诱变育种可以提高代谢产物的产量。新分离菌株必需多次诱变育种才能获得高产，生产菌种也需经过诱变育种提高产量，降低成本。2.改善菌种特性，提高产品质量：通过诱变育种可以改进产品质量，提高有效组分含量，还可以改善菌种特性，选育出更适合于发酵工业的突变株。3.开发新产品：通过诱变育种，可以获得各种突变株，其中有些能改变产业结构，有些能去除多余的代谢产物，有些能改变原有代谢途径，合成新的代谢产物。二、高产菌株诱变育种的特点诱变育种的主要目标是选育某种代谢产物合成能力强的高产突变株，代谢产物生产能力强弱是一种数量性状。1.遗传变异的质量性状：大多数典型的遗传性状是不连续的，即不同的基因型产生相当不同的表型，相互之间没有重叠。如孢子的颜色，形状；荚膜有无等形态特征，营养缺陷型等生理特征。2.遗传变异的数量性状：①是一个连续分布内的变化，例如抗生素、氨基酸、有机酸、核苷酸等微生物代谢产物的生产能力从高到低的差异是连续性差异。②数量性状是由多个基因的积累作用所控制，每个基因所起的作用是有限的，③环境条件在决定表型上起着很大的作用。因此，数量性状也被称为多因子、多基因或多基因座性状。3.特殊性状：除了质量性状和数量性状外的另一类性状，它的表型差异是不连续的，但它的控制却是数量的（连续的）。遗传因子和环境因子结合使得某些个体从一个表型状态达到另一个表型状态的界限。糖尿病和癌症就是这样的例子，基因型带来潜在的危险，但基因型和环境的共同作用促使某些个体越过由健康到患病的界限。数量性状及其特点：由他们的平均数（mean）和方差（variance）来描述。平均数通常记作x：X＝∑(Xi）／n分布的n范围称为方差，记作s2或V。方差的平方根s称为标准差（standarddeviation）。S2＝V＝∑（Xi－x）／（n－1）通常生物体系的变化程度大致处于正态分布中，这是一种理想的数学分布，它给出经典的钟形曲线，平均值s的区间内包括68.3％的个体测量值，平均值1.96s的区间内包括95％的个体测量值。4.高产菌株的诱变育种特点：①筛选工作量大：由于产量性状受多基因控制，其诱变过程十分复杂，诱变后产生高产突变株的频率很低，因此需要从大量群体中去筛选高产菌株。②筛选工作有一定的盲目性：由于数量性状的变异是连续的，选育高产菌株往往缺乏明确的正负效应，造成筛选工作具有一定的盲目性。③诱变育种工作难度较大：产量突变是许多细微突变的多次积累，高产菌株选育中多采用多步叠加累积诱变选育法。一般很难一次性得到产量大幅度提高的菌株；单个诱变阶段产量提高幅度不高，一般仅5－15％，这一幅度与亲本群体的生产能力波动范围差不多，加上操作误差也很大，有时甚至超过5－15％，所有这些都增加了诱变育种工作的难度。第二节诱变育种前的准备工作由于诱变育种工作量大,周期长,因此,在诱变育种前必需做好充分准备,如了解菌种的培养特征,了解培养基组分和培养条件对目标产物合成的影响等,并进行严格设计,以提高诱变育种的效率.一、了解影响菌种生长发育的主要因素1.培养基:①培养基的营养成分决定微生物的营养生长和生殖生长:培养基是影响菌种生长和孢子形成的重要因素之一,对产生孢子的微生物来说,培养基的营养成分是控制菌体生长和孢子形成的主要因素,营养太丰富,会促进菌丝大量生长而不利于孢子形成.②不同微生物对斜面培养基的要求不同:放线菌喜微碱性,孢子培养基的碳源/氮源比要低些.霉菌喜偏酸,孢子培养基的碳源要高些,氮源要低些.细菌喜偏碱,一般要求培养基的氮源丰富而碳源低些.2.斜面培养基制备技术:①除了培养基的营养成分外,培养基的配制技术也是非常重要的.②配制培养基时,要注意原料质量、规格,并要相对稳定;③培养基的灭菌时间、压力要适宜。④培养基加入的琼脂数量因条件不同而灵活掌握；⑤培养基装量也会影响孢子的形成。装量越多孢子不易形成。⑥培养基表面的冷凝水不宜过多。3.移种的密度：移种的密度要适宜，特别是丝状真菌，因为接种量过密，不同菌落间的菌丝会交织在一起，容易吻合产生异核体。适宜的接种量是使一个斜面上的菌落基本上能单独生长。4.温度:温度对菌种的影响很大，在培养过程中温度越高，生长越快，但超过一定的范围，会使生产能力下降，甚至引起变异，高温对菌种生产能力的影响很大。5.湿度：湿度也影响菌种生长和孢子形成。相对湿度高，生长慢，相对湿度低，生长快。放线菌在不同相对湿度下培养时，其形成的孢子数量有明显的影响。一般放线菌要求相对湿度约40－60％，而真菌要求相对湿度约70％。6.药品和原料的质量：药品规格和原料来源不同会影响菌种的质量。为了使菌种质量保持稳定，药品和原材料的质量应相对稳定，如有变动，要适当调整培养基的配比。二、了解菌株的菌落形态每个菌株在特定的培养基和培养条件下具有特定的菌落形态和培养特征。霉菌和放线菌的菌落形态特征通常包括菌落大小、形状、高度、放射线多少、外观组织结构（如粉状、绒毛状或絮状等）、孢子多少和色泽、可溶性色素等。细菌的菌落形态特征包括菌落大小、形状、高度、颜色、色泽、边缘结构、表结构、可溶性色素等。1.区分不同菌落类型：一般情况下，菌种在同一种培养基和培养条件下，往往会出现多种形态类型的菌落。不同类型的菌落，其生产能力有较大的差别；在特定的培养基和培养条件下，每个菌种都有其占优势的菌落类型，这种主要类型的菌落形态、特征、生理生化特性及其生产能力基本上决定了菌种的特性，这种菌落类型称为正常菌落。2.出现不同菌落类型的原因：1）主要由遗传因素造成。（1）自发突变：自发突变是一种常见现象。（2）回复突变：高产菌株在传代过程中会产生回复突变。（3）二倍重组体的分离：通过杂交或原生质体融合获得的二倍重组体在繁殖过程中产生分离子。（4）丝状菌异核体的孢子发生分离：丝状菌由于不同基因型的接触产生异核体,从异核体菌落上形成的孢子发生分离。2)非遗传因素:由非遗传因素引起的不同类型的菌落是一种假变异,不能遗传,即当菌种回到原来的培养基和培养条件下,其形态又可以恢复原状.(1)培养基组成不同;(2)配制培养基的药品、原材料来源、规格、质量的差别.(3)培养基平板厚薄不一引起营养、水分分配不均.(4)平板上菌落密度的稀密引起营养供应的差异.(5)菌落不同生长阶段,其形态特征不一.实验中应尽量避免由非遗传因素引起的菌落形态变化(培养基和培养条件应尽量保持一致,少变化),区分和识别不同菌落类型的特征,及其与生产能力之间的关系,对诱变育种具有非常重要的意义.三、了解菌种特性及其与生产性能的关系1.要多方面考察菌种的生活史,了解它们的形态、生理、生化等特性,以及这些特性与代谢产物合成的关系.如土霉素培养12d的单菌落包含了三代的生活周期,第一代新生孢子产生约需3-4d,第二代7d,第三代约10d,将1,2,3代新生孢子分别进行传代、保存、埋沙土,并测定生产能力,结果新一代能保持90%的原高产特性,二代只能保持50％，原高产特性，第三代仅保持10％的原高产特性。由此可见，用第一代孢子制备斜面生产能力最高，所以，单菌落或斜面的培养时间缩短为3－4d，用这样的孢子进行诱变育种就容易筛选到高产菌种。2.研究菌种生物学特性与产物合成的相关性，即对提高菌种产量有益的特性，如菌落大小、类型、产色素，斜面生长特点，种子生长情况，发酵情况等都可能与产量有关。如研究头孢菌素C产生菌－－顶头孢霉菌时发现抗生素产量随着节孢子体积增大或数量增加而提高。在合成培养基中加入甲硫氨酸后可增加节孢子的数量和抗生素的产量。同时还发现，基质菌丝颜色的变化和菌落直径与产量也有一定的关系，凡菌落有大变小伴随颜色由深变浅时，产量会逐步提高。3.研究菌种的最佳培养基和培养条件。由于微生物次级代谢产物常常是多组分的，在多组分代谢产物的发酵过程中，发酵培养基成分不同、发酵周期中的不同阶段，各组分的比例也不同。因此，在研究菌种的最佳培养基和培养条件时，需要研究培养基成分与各组分之间的关系，以及研究发酵过程中各组分之间的变化规律。四、建立一个准确、简便、快速检测产物的方法诱变育种工作量大，需从大量的分离菌株中去筛选才能获得高产突变株，因此，必须建立适合于大规模筛选的简便、快速的检测方法。五、研究合适的菌种保藏方法高产菌株或优良菌株来之不易，容易回复突变，使优良性状消失，因此要事先研究最佳的菌种保藏方法，以免高产菌株得而复失。第三节诱变诱变育种主要包括诱变和筛选两大步骤，其中诱变过程包括：出发菌株的选择、单孢子或单细胞悬浮液的制备、诱变剂及诱变剂量的选择、诱变的处理方法等。一、出发菌株的选择和纯化出发菌株是指用于诱变的试验菌株。出发菌株的选择是决定诱变效果的重要环节。长期育种的经验证明，诱变处理前选择怎样的出发菌株，以及对出发菌株的生物学特征的全面了解是很重要的。特别对菌种的遗传背景、稳定性、纯一性以及形态、生理、生化等特性的研究，都有利于提高诱变效果。1.选择具备一定生产能力或某种特性的菌株。菌株首先要具有我们所需要的特性，另外还应具备一定的生产能力，同时还应具有某种优良特性（如产孢子多，不产或少产色素，生长快、糖氮利用快，耐消泡，黏度小等）。2.选择纯种做出发菌株：用于诱变的菌株，其遗传性状应该是纯的，即细胞在遗传上应该是同质性的。诱变中要尽量选择单倍体、单核或少核的细胞作为出发菌株。因为诱变剂处理后的变