第二章--提取、分离与鉴定的方法与技术7

第二章天然药物化学成分提取分离和鉴定的方法与技术第一节提取方法与技术第二节分离精制和鉴定的方法与技术第二章天然药物化学成分提取分离和鉴定的方法与技术第二节分离精制和鉴定的方法与技术一、系统溶剂分离法第二章天然药物化学成分提取分离和鉴定的方法与技术二、两相溶剂萃取法三、沉淀法四、结晶与重结晶法五、透析法六、分馏法七、色谱法1.概念：色谱法又称层析法利用混合物中各成分的物理和化学性质差异，使各成分得到分离的一种方法。广泛地应用于天然药物化学成分的分离、纯化和鉴定。结构类似的化合物的分离，效果良好。分离、分析的重要工具！2基本原理利用混合物中各成分在固定相和移动相中吸附、分配及其亲和力的差异而达分离。3分类：(1)按移动相状态不同分类：液-固色谱①液相色谱液-液色谱气-固色谱（GSC）很少应用②气相色谱气-液色谱（GLC）(2)按原理分类①吸附色谱②分配色谱③离子交换色谱（IEC）④凝胶色谱（GFC）(3)按操作形式和载体的不同分类①柱色谱（吸附柱色谱LSC、分配柱色谱LLC）②纸色谱（PC）③薄层色谱（TLC）④气相色谱(GC)⑤高效液相色谱(HPLC)4应用按被分离成分性质和各色谱法的特点进行选择。七、色谱法柱色谱法第二章天然药物化学成分提取分离和鉴定的方法与技术薄层色谱法纸色谱法高效液相色谱法气相色谱法柱色谱法吸附柱色谱法第二章天然药物化学成分提取分离和鉴定的方法与技术分配柱色谱法离子交换柱色谱法凝胶柱色谱法学习目标：1.掌握吸附色谱分离法的原理和常用吸附剂的类型。2.掌握根据被分离成分的性质选择吸附剂和移动相的原则。3.熟悉柱色谱法的操作技术和适用范围。(一)柱色谱法柱色谱法（columnchromatography）：常用,也是色谱法最早出现的形式。它将分离材料均匀地加入到一定规格的玻璃柱中，再以适当的洗脱剂进行洗脱，使结构性质不同的成分达到分离。特点：分离样品量大，多为制备性分离。分类：按分离机理不同可分为吸附柱色谱、分配柱色谱、离子交换色谱和凝胶色谱等。1吸附柱色谱法吸附柱色谱法是一种在柱状容器中，利用吸附剂对混合物中各成分吸附能力的差异而进行分离的方法。(1)基本原理利用吸附剂对混合物中各成分的吸附能力的差异，以及流动相对各成分解吸附能力的差异，而使各成分得以分离。过程：当流动相流过吸附剂时，各成分在吸附剂和流动相之间连续地发生“吸附、解吸附、再吸附、再解吸附”。被吸附剂吸附力大的成分难被流动相解吸附，迁移速度慢,而被吸附剂吸附力小的成分易被流动相解吸附，迁移速度快，最后，由于各成分的迁移速度不同而达到分离。(2)吸附剂吸附剂是吸附色谱法中的固定相，在吸附色谱中的重要因素。吸附剂应具备的条件：①吸附剂应具有较大的表面积和足够的吸附能力，颗粒要均匀，具有一定的细度；②不与流动相、溶剂及样品中各成分发生化学反应；③在流动相及所用的溶剂中不溶解。吸附剂对成分的吸附作用可分为：化学吸附、半化学吸附和物理吸附。化学吸附：具有选择性，吸附剂与成分之间吸附能力强，难洗脱。如用酸性硅胶分离生物碱和用碱性氧化铝分离酸性的黄酮等，分离时应尽量避免使用。半化学吸附：介于化学吸附与物理吸附之间，有一定的选择性，如聚酰胺与黄酮类化合物的氢键吸附，结合力较弱，过程可逆，可以使用。物理吸附：是一种表面吸附，无选择性，过程可逆，吸附强弱及物质的迁移速度与成分的极性有关，遵循“相似者易吸附”的原则，是主要的分离方式。吸附剂的吸附能力与吸附剂本身的性质、有效表面和含水量有关。吸附剂按其本身的性质可分为两大类：极性吸附剂****：对极性大的成分吸附能力强，吸附剂如：硅胶,氧化铝等。非极性吸附：对非极性成分吸附能力强，如：活性炭。常用的吸附剂：硅胶、氧化铝、硅藻土、氧化镁、碳酸钙、聚酰胺和活性炭等。1）硅胶硅胶是一种弱酸性*吸附剂。用SiO2•XH2O表示，是多孔性物质，分子表面有很多硅醇基，能通过氢键吸附水分。其吸附作用是由硅醇基产生的，吸附作用的强弱与游离硅醇基数目有关。被分离成分因极性和不饱和程度不同，与硅醇基相互作用的程度也不同，因而得以分离。硅胶的分离效率与其粒度、孔径和表面积有关。硅胶的粒度越小，均匀性越好，分离效率越高；硅胶的表面积越大，与样品相互作用越强，吸附力越强。此外，还与其含水量有关。硅胶分子中硅醇基通过氢键吸附水分达到饱和（当含水量达17％以上）时，硅胶便失去了吸附活性，不能再作吸附剂，但可作分配色谱中的支持剂。若用加热方法除去硅醇基上的水分，可使硅胶恢复吸附力。活化：是加热除去吸附剂中部分水分，使其吸附力增强的过程称为活化。硅胶活化：100～110℃，30min当温度升高至500℃时，由于硅胶结构内的水（结构水）不可逆地失去，使表面硅醇基也脱水缩合转为硅氧烷醚结构，从而导致其吸附能力显著下降，不再有吸附剂的性质，再用水处理也不能恢复其吸附性，因此，硅胶的活化不宜在较高温度下进行。适用范围：硅胶为酸性吸附剂，适用于中性和酸性成分的分离。样品与硅胶用量比：一般为1:30～1:60,对较难分离者，可用到1:500～1:1000。市售硅胶的型号：硅胶G（含有煅石膏14～22％）、硅胶或硅胶H（既不含黏合剂，也不含荧光物质）、硅胶S（含有淀粉）、硅胶F（是在吸附剂中加入有254nm或365nm波长下能发生荧光的物质），如硅胶F254或硅胶F365。2）氧化铝色谱用的氧化铝是由氢氧化铝在400～500℃灼烧而成，因制备和处理方法的差异，可分为碱性、中性和酸性3种。氧化铝是极强的亲水性吸附剂，其中又以碱性氧化铝吸附力最强,其活性也和含水量有关，含水量愈多、吸附能力愈弱。①碱性氧化铝（pH9～10）适于生物碱，甾醇类等碱性或中性成分的分离。碱性氧化铝有时会与醛、酮、酯和内酯类成分发生异构化、氧化和消除化反应。故不宜用于醛、酮、酯和内酯类成分的分离。②中性氧化铝（pH6.5～7.5），主要适用于萜、醛、酮、皂苷等中性或对酸碱不稳定的成分的分离。③酸性氧化铝（pH4～5）适用于有机酸、氨基酸等酸性成分以及对酸稳定的中性成分的分离。样品与氧化铝用量比：在1:20～1:50之间，极性弱的碳氢化合物，可增至1:100～1:200。粒度要求：柱色谱用的氧化铝，其粒度要求在100～160目之间。市售规格：氧化铝因黏合剂或荧光剂不同可分为氧化铝或氧化铝H、氧化铝G、氧化铝HF254、氧化铝GF365等不同类型。氧化铝、硅胶活度与含水量关系活度等级氧化铝（含水量%）硅胶（含水量%）Ⅰ00Ⅱ35Ⅲ615Ⅳ1025Ⅴ15383）聚酰胺聚酰胺：又称绵纶、尼龙，是由酰胺聚合而成的一类高分子化合物。种类较多，色谱常用聚已内酰胺（绵纶6）难溶于水及乙醇,可溶于浓盐酸和甲酸。其结构式为：CH2CH2CH2CH2OCH2CNHn分离原理**：氢键吸附聚酰胺分子中，因含有多个酰胺键,故能与酚羟基、羧基、醌基等形成氢键吸附而分离。由于各成分与聚酰胺形成氢键的能力不同而得以分离。适用范围：主要用于分离含有酚羟基的成分如黄酮，含醌基的化合物如蒽醌类，以及含羧基的化合物如氨基酸等。聚酰胺对鞣质的吸附近于不可逆，故可用水提取液中鞣质的脱鞣处理。影响聚酰胺与被分离成分形成氢键的因素**有：①被分离成分的结构化合物分子能形成氢键的基团（如酚羟基、羧基、醌基等）越多，则被聚酰胺吸附越强，洗脱时越难洗脱。如：OHOHOH＞＞OHHOOHHOOH＞OHOOOHOHOHOHOOOHOH与形成氢键的基团所处位置不同，其被吸附的强度也不同。一般对位、间位酚羟基被吸附的强度要大于邻位酚羟基。分子内芳香化程度越高、共扼双键越多,则被吸附性越强，如：OHOHOHOHOH＞OH＞OHOHOH＞＞能形成分子内氢键者被吸附强度小，如：②溶剂的种类聚酰胺与各种成分一般在水中形成氢键缔合能力较强，在有机溶剂中较弱，在碱性溶剂中最弱。各种溶剂在聚酰胺柱上的洗脱能力，由弱至强的顺序**为：水甲醇或乙醇(浓度由低至高)丙酮稀氢氧化钠水溶液或稀氨溶液甲酰胺甲基甲酰胺尿素水溶液COOHHOOHOOH----＞4）活性炭活性炭：非极性吸附剂，有较强的吸附能力，特别适合于水溶性物质的分离。可分三类：①粉末状活性炭颗粒极细、呈粉末状，比表面积大，故吸附力及吸附容量也大，是活性炭中吸附力最强的一类。但在柱色谱过程中流速较慢，需加压或减压操作。常需加入适量硅藻土作助溶剂一并装柱，以免流速太慢。②颗粒状活性炭颗粒较前者大，比表面积则相应减少,吸附力和吸附容量也均小于前者，但在色谱过程中流速较快易于控制，是色谱最常选用的活性炭。③锦纶活性炭以锦纶为黏合剂，将粉末状活性炭制成粒状活性炭。比表面积介于上述二者之间，吸附力比两者皆弱。用于分离酸性和碱性氨基酸效果良好。适用范围：活性炭柱色谱主要用于分离氨基酸、糖类及某些苷类等水溶性成分。活性炭对不同物质的吸附力也不一样。对极性基团多的化合物吸附力大，而对极性基团少的化合物则吸附力小；对芳香族化合物的吸附力大于脂肪族化合物；对分子量大的化合物的吸附力大于分子量小的化合物。例如对多糖的吸附力大于对单糖的吸附力；对羟基脯氨酸的吸附力大于脯氨酸的吸附力。可利用活性炭对上述几类化合物吸附力差别而将它们分开。活性炭在水溶液中吸附力最强，在有机溶剂中较弱。故：水洗脱能力最弱，而有机溶剂则较强，碱性溶剂的洗脱能力最强。(3)移动相（洗脱剂、展开剂）习惯上将柱色谱所用的溶剂称洗脱剂，用于薄层色谱或纸色谱的溶剂称展开剂。用吸附色谱法分离混合物时，移动相的选择对分离效果影响极大。移动相应该具备以下条件***：①具备较高纯度，不含水分；②与样品、吸附剂不发生化学反应；③对被分离成分有一定的溶解度；④黏度小；⑤易挥散等。洗脱剂的选择***应根据被分离物质的极性和吸附剂的性质综合考虑。分离极性强的成分，宜选用极性溶剂为洗脱剂；分离极性弱的成分，宜选用弱极性溶剂为洗脱剂。中等极性成分则选用中间条件进行分离。一般地，溶剂极性与其洗脱能力成正比。常用单一溶剂的极性顺序为：石油醚环已烷二硫化碳四氯化碳三氯乙烷苯甲苯二氯甲烷氯仿乙醚乙酸乙酯正丁醇丙酮乙醇甲醇吡啶酸水。单一溶剂为洗脱剂，分离重现性好，组成简单，但往往分离效果不佳。故在实际工作中常采用二元、三元或多元溶剂系统作洗脱剂。洗脱时应该由小极性溶剂开始，逐渐增大洗脱剂的极性。如果极性增大过快，往往不亦获得满意的分离效果。(4)被分离成分吸附色谱的三要素：被分离成分、吸附剂和洗脱剂共同构成。在吸附剂与洗脱剂已定情况下，各成分的分离直接与被分离成分的结构和性质有关。对硅胶、氧化铝等极性吸附剂来说，被分离成分的极性越大，被吸附剂吸附就越牢固，洗脱就越困难。化学成分的极性大小，与成分的结构有关。①化合物分子母核大小和碳链的长短：分子大、碳原子数多，极性小，被极性吸附剂吸附不牢固，容易洗脱；分子小、碳原子数少，极性大，被极性吸附剂吸附牢固，不易洗脱。②取代基极性大小：当母核相同或相近时，成分的极性小主要取决于取代基极性。取代基极性越大或极性取代基数目越多，成分的极性也越大。常见基团极性大小顺序如下：－CH3，－CH2－＜－CH＝CH－＜－OCH3，－O－CH2－＜－NO2＜－N(CH3)2＜－COOR＜C=O＜－CHO＜－SH＜－NH2＜－NH－＜－COCH3＜－OH＜Ar－OH＜－COOH③结构中双键或共轭双键数目增加，化合物极性增大。被分离成分结构不同其极性也不相同，只要极性有差别就有可能获得分离，关键在于条件的选择：要根据被分离成分的极性来选择吸附剂与洗脱剂*。在实际工作中常常是在吸附剂和固定相已确定的情况下，根据各成分的极性来判断它们迁移速度（即Rf值）的大小。在吸附剂、移动相和温度等色谱条件一定的情况下，根据不同成分的迁移速度不同、同种成分的迁移速度相同这一性质，可以对化学成分进行分离和定