分析仪器的维护第四章(后)

第二节液相色谱仪高效液相色谱是一种以液体作为流动相的新颖、快速的色谱分离技术。近年来，随着这一技术的迅猛发展，高效液相色谱分析已逐渐进入“成熟”阶段，在生命科学、能源科学、环境保护、有机和无机新型材料等前沿科学领域以及传统的成分分析中，高效液相色谱法的应用占有重要的地位。高效液相色谱的仪器和装备也日益趋于完善和“现代化”，可以预期，在不远的将来，高效液相色谱仪必将和气相色谱仪一起，成为用得最多的分析仪器。一、液相色谱仪的结构、原理及流程高效液相色谱仪的基本组件包括四个部分，即溶剂输送系统、进样系统、色谱分离系统和检测记录及数据处理系统。其工作流程如图4—29所示图4—29高效液相色谱流程示意图贮液槽中的溶剂经脱气、过滤后，用高压泵以恒定的流量输送至色谱柱的入口（如采用梯度洗脱则需用双泵系统输送溶剂，流动相中各溶剂所占比例由梯度装置控制。），欲分析样品由进样装置注入，在洗脱液（流动相）携带下在色谱柱内进行分离，分离后的组分从色谱柱流出进入检测器，产生的电信号被记录仪记录或经数据处理系统进行数据处理，籍以定性和定量。废液罐收集所有流出的液体。高效液相色谱仪的基本组件已如上述，其中最重要的工作单元是高压泵、色谱柱、检测器和数据处理系统。1．液相色谱系统（1）高压泵高压泵是高效液相色谱仪中最重要的部件之一。在气相色谱中，是利用高压钢瓶来提供一定压力和流速的载气；而在高效液相色谱中，则是利用高压泵来获得一定压力和流速的载液。因为在高效液相色谱中，所用色谱柱较细（1~7mm），固定相颗粒又很小（粒度只有几~几十微米），因此色谱柱对流动相的阻力很大。为了使洗脱液能较快地流过色谱柱，达到快速、高效分离的目的，就需要用高压泵提供较高的柱前压力，以输送洗脱液。高压泵通常应满足下列要求：a.提供高压。一般为1.47×104～3.43×104KPa(150~350kg/cm2)。b.压力平稳，无脉冲波动.c.流速稳定，有一定的可调范围。d.能连续输液，适于进行梯度洗脱操作。e.密封性能好，死空间小，易于清洗，能抗溶剂的腐蚀。高压泵的种类很多，分类方法也不相同。通常按照输送洗脱液的性质可分为恒流泵和恒压泵两类。①恒流泵这种泵能使输送的液体流量始终保持恒定，而与外界色谱柱等的阻力无关，即洗脱液的流速与柱压力无关。因此能满足高精度分析和梯度洗脱的要求。常用的恒流泵是往复式柱塞泵，它是目前高效液相色谱仪中使用最广泛的一种恒流泵。往复式柱塞泵的构造与一般工业用高压供液泵相似，惟体积较小，主要组成包括马达传动机构、液腔、柱塞和单向阀等，如图4—30所示。由马达带动的小柱塞（φ3mm左右），在密封环密封的小液腔内以每分钟数十次到一百多次的频率作往复运动。当小柱塞抽出时液体自入口单向阀吸进液腔；当柱塞推入时，入口单向阀受压关死，液体自出口单向阀输出。当柱塞再次抽出时，管路中液体的外压力迫使出口单向阀关闭，同时液体又自入口单向阀吸入液腔内。如此周而复始，压力渐渐上升，输出液体的流量可借柱塞的冲程或马达的转速来控制。往复式柱塞泵的优点是泵的液腔体积小（约1/3~1/2毫升），输液连续，输送液体的量不受限制，因此，十分适合于梯度洗脱；而且泵的液腔清洗方便，更换溶剂非常容易。缺点是随柱塞的往复运动而有明显的压力脉动，因此液流不稳定，易引起基线噪声。克服的方法是外加压力阻滞器，使液流平稳。图4－30往复式柱塞泵②恒压泵与恒流泵不同，恒压泵保持输出压力恒定，液流的流速不仅取决于泵的输出压力，还取决于色谱柱的长度、固定相的粒度、填充情况以及流动相的粘度等。因此恒压泵的流速不如恒流泵精确，适用于对流动相流速要求不高的场合。这种泵通常具有结构简单，价格低廉的特点。其中较为重要的是气动放大泵。气动放大泵是最常用的恒压泵，它以高压气瓶为动力源，由气缸和液柱两部分组成，其结构原理如图4-31所示。气缸内装有一个可以作往复运动的活塞，在活塞轴心上连有一液缸活塞，气缸活塞的面积A1大于液缸的面积A2。设气缸压强为P1，液缸压强为P2，因为F1=F2，则：图4－31气动放大泵示意图气缸活塞与液缸活塞的面积比大约为30:1~50:1，通常采用45:1。当以98KPa(1Kg/cm2)压力的气体推活塞时，液缸活塞端面即有4.4×103Kpa(45Kg/cm2)的压力（不计摩擦力），将液缸内液体排出，调节气体压力即可改变输出液体的压力。工作时，在恒定气压的作用下，推动气缸活塞使液缸中液体被液缸活塞推出，经出口单向阀输出，当活塞到达行程终点时，启动微型开关，使电磁阀工作带动气体切换装置反向，使气流方向倒转（即气体进、出口互易），驱动活塞按相反方向运动。此时出口单向阀因外部高压液流的反压力而关闭，洗脱液便通过入口单向阀被吸入液缸。当液缸吸满液体后，气体切换装置再次使气流方向倒转，推动活塞正向前进，液体又被从出口单向阀推出，而入口单向阀受压关闭。如此周而复始地进行输液和吸液。气动放大泵重装液体的动作很快，通常在数秒钟内即可完成。气动放大泵的优点是容易获得高压，能输出无脉动的流动相，对检测器噪声低，通过改变气源压力即可改变流速，流速可调范围大，泵结构简单，操作和换液、清洗方便。缺点是流动相流速与流动相粘度及柱渗透性有关，故流速不够稳定，保留值的重现性较差，不适于梯度洗脱（除非使用两台泵）操作。因此，目前这种泵主要适用于匀浆法填装色谱柱。③梯度洗脱装置在高效液相色谱法中，对于极性范围很宽的混合物的分离，为了改善色谱峰的峰形，提高分离效果和加快分离速度，可采用梯度洗脱操作方法。所谓梯度洗脱，就是将两种或两种以上不同极性的溶剂混合组成洗脱液，在分离过程中按一定的程序连续改变洗脱液中溶剂的配比和极性，通过洗脱液中极性的变化来达到提高分离效果，缩短分析时间目的的一种分离操作方法。它与气相色谱中的程序升温有着异曲同工之处，不同点在于前者连续改变流动相的极性，后者是连续改变温度，其目的都是为了改善峰形和提高分辨率。梯度洗脱可分为外梯度洗脱和内梯度洗脱两种方法。A.外梯度洗脱将溶剂在常压下，通过程序控制器使之按一定的比例混合后再由高压泵输入色谱柱的洗脱方式叫外梯度洗脱。图4-32所示的是一种较简单的外梯度洗脱装置。容器A、B中装有两种不同极性的溶剂，利用两容器中液体重力的不同和通过控制开关的大小来调节B容器中溶剂进入A容器的数量，再经不断搅拌混和后输入到高压泵中去。当洗脱液需用多种溶剂混合而成时，可在各贮液槽中，装入不同极性的溶剂，通过一个自动程序切换阀，使按一定的时间间隔，依次接通各贮液槽通路。然后由一个可变容量的混合器进行充分混合，输入到高压泵。图4－32固定容器外梯度洗脱装置B.内梯度洗脱内梯度洗脱又叫高压梯度洗脱，它是将溶剂经高压泵加压以后输入混合室，在高压下混合，然后进入色谱柱的洗脱方式。常见的一种内梯度洗脱装置如图4-33所示。这种装置采用两台高压泵，当控制两泵的不同流速使各溶剂按不同的流速变化，再经充分混合后，即可得到不同极性的洗脱液。这种方法的优点是只要程序控制每台泵的输液速度，就可以得到任何形式的梯度。其缺点是需要两台高压泵，价格较昂贵，而且只能混合两种溶剂。该系统由于溶剂是在常压下混合，然后用泵输送至色谱柱内，所以又叫做低压梯度洗脱系统。为了保证溶剂混合的比例，外梯度洗脱装置都采用液腔体积小的往复式柱塞泵或隔膜泵。外梯度洗脱的优点是结构较简单，只需要一台泵。采用自动程序切换装置的外梯度洗脱系统还可克服自动化程度较低，更换溶剂不方便，耗费溶剂量大的缺点。图4-33内梯度洗脱装置之一另一种梯度洗脱装置是将溶剂A装在一个容器内，使之直接抽入泵内，溶剂B装于另一个容器内，需要时可由阀门c、e注入螺旋贮液管内，如图4－34所示。阀门a、b为高压液体电磁阀。梯度开始时，阀门c、d处于关闭，打开阀门e，由控制电路控制电磁阀a、b的相互交替的开启时间，使溶剂A由高压泵经阀a压出，或者由高压泵压出的A溶剂来顶出螺旋贮液管中的B溶剂，这样按一定的时间间隔交替进行，两种溶剂在混合器中充分混合后进入色谱柱。不同的梯度方式只需控制电磁阀a、b的开启时间长短便可得到。这种装置的优点是只需一台高压泵，但仍需两只高压电磁阀门。图4－34内梯度洗脱装置之二(2)色谱柱色谱分离系统包括色谱柱、恒温器和连接管等部分，其中色谱柱是高效液相色谱仪的心脏部件。因为如果没有一根高分离效能的色谱柱，则性能良好的高压泵、高灵敏度的检测器和梯度洗脱装置的应用都将失去意义。高效液相色谱法中最常用的色谱柱是由不锈钢合金材料制成的，当压力低于6.9×103KPa(70Kg/cm2)，也可采用厚壁玻璃管。一根好的色谱柱应能耐高压，管径均匀，特别是内壁应抛光为镜面。但由于不锈钢柱管不易加工，所以也有改用不锈钢管内壁涂衬一层玻璃或聚四氟乙烯以达到上述目的。为了使固定相易于填充，色谱柱的形状多采用直型柱，柱长通常为10~50厘米，内径为1~7毫米。(3)检测器检测器是测量流动相中不同组份及其含量的一个敏感器。其作用是将经色谱柱分离后的组份随洗脱液流出的浓度变化转变为可测量的电信号（电流或电压），以便自动记录下来进行定性和定量分析。它与色谱柱是高效液相色谱仪的两个主要组成部分。对液相色谱检测器的一般要求是：灵敏度高、噪音低、对温度和流速的变化不敏感、线性范围宽、死体积小及适用范围广等。到目前为止，还没有一种很理想的高效液相色谱检测器，检测器尚是高效液相色谱仪中较为薄弱的环节。检测器通常分成两类：通用型检测器和选择性检测器。前者如示差折光检测器等；后者如紫外吸收检测器、荧光检测器、电导检测器等。目前应用范围最广和最常用的两种检测器是紫外吸收检测器和示差折光检测器。①紫外吸收检测器紫外吸收检测器是目前高效液相色谱中应用最广泛的检测器。其检测原理是利用样品中被测组份对一定波长的紫外光的选择性吸收，吸光度与组份浓度成正比关系，而流动相在所使用的波长范围内无吸收，因此可以定量检出待测组分。一种双光路结构的紫外吸收检测器的光路图如图4－35所示。H－低压汞灯；L1、L2、L3、L4、L5－透镜；W－遮光板；C1－样品池；C2－参比池；F1、F2－滤光片；P－棱镜；E1、E2－光电管。图4－35紫外吸收检测器光路图光源通常采用低压汞灯。由低压汞灯H发出的光线经过透镜L1聚焦为平行光，通过遮光板W后被分成一对细小的平行光束，分别通过透镜L2、L3到达样品池C1和参比池C2，当样品自色谱柱分离后流入样品池时，由于样品对紫外光的吸收，使样品光路与参比光路之间的光强产生差异。两束强度不同的光分别经滤光片F1、F2除掉不需要的其它波长的非单色光后照射于两个配对的光电管，转换为电信号，其差值经放大后即可检测。为了减小色谱峰的扩张，检测池的体积应该小一些，目前标准的紫外吸收检测器的检测池是长10mm，直径1mm，池体积8μl。其结构常采用H型或Z型，如图4－36所示，而以H型结构更为合理。根据所使用的波长可调与否，紫外吸收检测器又可分为固定波长式和可调波长式两种。H型Z型图4－36样品池结构示意图固定波长紫外吸收检测器：这种检测器采用固定的波长，测定波长一般有254nm和280nm，多数的仪器只能在这两种波长中的某一种波长下进行工作。最常用的是254nm，这种检测器一般都采用低压汞灯作光源，因为低压汞灯在紫外区谱线简单，其中254nm的谱线强度最大。可调波长紫外吸收检测器：这种检测器与固定波长紫外吸收检测器的主要差别在于使用一个连续光源（如氘灯），以及光栅（或滤光片），它实际上相当于一台紫外—可见分光光度计，其波长范围一般为210～800nm。更为先进的仪器可在色谱分析过程中随时将流动相暂时停下来对某个感兴趣的色谱峰相应的组份进行波长扫描，从而得到这个峰组分的紫外—可见吸收光谱，以获得最大吸收波长数据，这种方法称做“停流扫描”。紫外吸收检测器的优点是灵敏度高，最小检测浓度可达10-9g/ml，因而即使是那些对紫外光吸收较弱的物质，也可用这种检测器进行检测。此外，这种检测器结构简单、使用方便，对温度和流速的变化不敏感，是用于梯度洗脱的一种理想的检测器。缺点是只能用于对紫外光有吸收组份