神经生物学研究方法

神经生物学常用的研究方法一、结构的研究：形态学方法二、生理学方法：生理功能的研究三、对脑功能定位的研究四、行为学研究方法1）HE、尼氏染色、免疫组化（荧光）、原位杂交等2）神经束路追踪法：轴浆运输追踪法、变性束路追踪法3）神经组织培养观察4）影像学检测一、结构的研究：形态学方法WTMUP7P10P13P15-P21P7P10-P14Camk2-cre;foxg1L1controlMUCamk2-cre;foxg1;Rosa-gfpGFP40000XPSD/Activezone宽度、囊泡数量、囊泡数量与activezone相对值150000XAdultTM7rest14GolgistainingFoxg1f/fCamk2-creer;Foxg1f/fWTMU*****************0246810121416102030405060708090100110120130140frequencyofintersectionsDistancefromsoma(μm)(*P0.05;**P0.01;***P0.001)DendritesbranchcomplexityofpyramidalcellinSensorycortexWTMUDendritesbranchcomplexityofpyramidalcellsinSensorycortex示踪WTMUCamk2-cre;foxg1ADTM5-15DIL示踪报告基因示踪P2P6P17P4组织培养组织培养kowt影像学检测二、生理学方法：生理功能的研究LTP：当突触前的传入纤维受到高频刺激时，兴奋性神经递质谷氨酸从突触前膜到突触间隙，和突触后膜上的NMDA受体结合，激活NMDA受体，使阻碍钙离子内流的镁离子被移除，大量钙离子内流，激活细胞内的一系列分子过程，最终形成LTP。（1）钙离子（2）NMDA（3）aCaMKII（4）PKA（5）AMPA（6）PSD-95三、对脑功能定位的研究脑立体定位技术、手术与电刺激脑电图与影像学观察瑞士学者赫斯(W.R.Hess，1881-1973)运用脑立体定位技术对下丘脑功能作了详细、深入的研究，从而开启了进行脑深部研究的大门。1935年，葡萄牙精神病学家莫尼兹（A.C.Moniz,1874-1955）设计了双侧前额叶脑白质切断术，结果手术成功并取得令人满意效果，从而开创了真正的精神外科。以上两项方法学进步，为进一步研究脑功能和手术治疗某些脑部疾病创造了必要条件。赫斯和莫尼兹共同获得了1949年诺贝尔奖。脑立体定向术己成为现代精神外科中最主要的手术方法。Ａ.Ｃ.Moniz,1874-1955W.R.Hess，1881-1973四、行为学研究方法Iamdepressed.Metoo.人类脑功能障碍神经精神疾病治疗干预诱发减缓理想的动物模型动物脑功能障碍行为/认知障碍治疗干预诱发减缓动物模型的神经生物学原理及病理学机制应和人类疾病的病理学机制一样或类似动物表现出和神经精神疾病病人相同的行为模式动物模型应能对已知的抗精神病药物处理作出相应的反应或治疗前景机理有效性表观有效性预测有效性BehavioraltestsT-maze/radioarmmaze:spatialworkingmemoryWatermaze:learning/spatialreferencememory/workingmemoryObjectRecognition:novelobjectlearning/placelearningSensorygating:prepulseinhibition,latentinhibitionclassicalfearconditioningInformationprocessingOpenfield:spontaneousactivityElevatedplusmaze:anxietyDepression:tailsuspensiontest,forcedswimtestSucrosepreferencetest,socialinteraction,Learning/memory/cognitionBasicOpenFieldElevatedPlusMazeFreeexplorationfor5minMainmeasurement:Distancemovedinthemaze,%TimespentinOpenArms:[time(open)/(totaltime)]Riskassessment,etc.(anxiety)(EthoVisionsystem)SocialinteractiontestTailsuspensiontest(TST)•应激模型小鼠悬尾法（tailsuspensiontest），一种行为绝望法。将小鼠倒悬在实验小室内，观察5分钟内不动时间。抗抑郁药可减少不动时间Forcedswimtest(FST)强迫游泳实验(forcedswimmingtest)动物在恶劣环境下不能逃逸时，便出现行为绝望(behaviouraldespair)，处于一种不动状态（immobility）是一种有效地评价抗抑郁药的大鼠抑郁模型。T-maze(SpatialWorkingMemory)SamplerunChoicerun+-?+Mainmeasurement:(6trials/day)%Correctresponse(Runninglatency)(Elapsedbetweentheopeningofthestem-doorandtheclosingofthearm-door)ObjectRecognitionTheanimalisfamiliarizedwithtwoidenticalsampleobjects.Followingaretentionintervaltheanimalisre-exposedtoathirdcopyofthenowfamiliarizedsampleobjectandanovelobjectinthetestphase.Theexplorativepreferencetowardsthenoveloverthefamiliarobjectservesasindexmeasuretoassessrecognitionmemoryfortheidentityofobjects.(EthoVisionsystem)WaterMazeB.ForworkingmemoryA.ForreferencememoryPrepulseinhibition,latentinhibition前脉冲抑制是指机体在先受到一个前脉冲刺激后，对随后受到的强听觉刺激的惊吓反应产生弱化或降低的现象。潜伏抑制是指机体在受到重复的条件刺激（CS）却又没有配以强化刺激（非条件刺激US）后（即预暴露），机体随后对该条件刺激产生的条件反应将受到弱化或减小。这可以用来评判机体忽略无关刺激的一种能力。这两种模型都反映了大脑在信息处理过程中，对注意力信息处理的门控机制。在精神分裂症病人身上可见到这些机制受到损害。ASR:PPI:听觉惊吓反射的前脉冲抑制：听觉惊吓反射(ASR)：当动物受到一个强烈的听觉刺激时就会引起一种惊吓反应，即听觉惊吓反射前脉冲抑制（PPI）：当动物受到一个强烈的听觉惊吓刺激（刺激脉冲）之前，动物已先受到一个较微弱的刺激（前脉冲），那么此时动物对该惊吓刺激（刺激脉冲）的惊吓反射就会大大减弱。惊吓反射是哺乳动物的一种最强的全身性反射活动，它可以由突发性的强感觉刺激所引起，并具有潜伏期短、刺激的累加作用强、和反应的动态范围宽等特点听觉惊吓反射的前脉冲抑制：(SOA=Stimulusonsetasynchrony刺激时间间隔)Prepulse(S1)Pulse(S2)SOA=100msPulsetimetime=P∆=PPIp=failuretogatestimulileadstosensoryoverload,thatmaybelinkedtoattentionaldeficitand“cognitivefragmentation”sensorygatinginnormalsubjectsBraff&Geyer(1990)那么这个前脉冲又是如何“门控”这个刺激脉冲的呢？当动物受到这个前脉冲刺激时，动物大脑就开始工作并处理这一前脉冲信息，与此同时也会阻止其他的刺激信号进来，就像“门控”一样。这是为了避免感觉信息泛滥，不让太多的感觉信息传入。这反映了机体的一种中枢抑制过程，以便保证正在进行的信息处理过程不受另外刺激的干扰。前脉冲抑制缺损可以理解为机体对前脉冲的信息处理能力减弱。精神分裂症表现出较小的前脉冲抑制（PPI），说明其“门控”机制受损：因此太多的信息进入大脑以致泛滥。获得性无助法(learnedhelplessness)大鼠遭受无法逃避的电击以后，将其放在可以逃避电击的环境下，呈现逃避(escape)行为障碍.不可予测性长期应激实验（chronicunpredictablcstress）大鼠在遭受长期应激后出现一系列情绪性行为改变，如自发活动减少、学习能力下降、食欲减退、快感缺失（anhedonia）.电击、振荡、光刺激、声、寒冷、禁食、禁水、倾斜45°的饲养笼、湿笼等。电刺激诱发的不动状态动物模型，可作为一种比较理想的抗抑郁药物研究和筛选。孤养或分养模型•灵长目动物母仔分离模型，可作为抗抑郁药的初筛其他动物模型•地鼠的压抑模型，用来揭示抑郁患者脑内的神经生化机能变化•社会竞争失败树鼩•神经环路活性降低小鼠模型5-HT1A受体敲除抗抑郁表型糖皮质激素受体基因损伤抗抑郁表型，焦虑相关的行为减少(有待进一步确定)5-HT1B受体敲除拮抗抗抑郁表型，对SSRI类抗抑郁药敏感性增加谷氨酸脱羧酶基因敲除抗抑郁表型DA-β-羟化酶基因敲除拮抗抗抑郁表型神经细胞黏附分子基因敲除抗抑郁表型α2A-肾上腺素能受体基因敲除抑郁表型，并拮抗抗抑郁表型TNFα基因敲除抗抑郁表型α2C-肾上腺素能受体基因敲除抗抑郁表型血管紧张素基因敲除抗抑郁表型α2C-肾上腺素能受体基因过表达抑郁表型腺苷受体基因敲除抗抑郁表型NE转运子基因敲除抗抑郁表型速激肽NK1受体基因敲除抗抑郁表型单胺氧化酶A基因敲除抗抑郁表型IL-6基因敲除拮抗抗抑郁表型单胺氧化酶B基因敲除抗抑郁表型多巴胺D5受体基因敲除抗抑郁表型μ阿片受体基因敲除抗抑郁表型DARPP基因敲除对盐酸氟西汀敏感性降低δ阿片受体基因敲除抑郁表型CREB突变抗抑郁表型Gα-G-蛋白敲除拮抗抗抑郁表型BDNF条件性基因敲除抗抑郁表型，对电击敏感性降低5-HT1A受体敲除抗抑郁表型TrkB基因敲除抗抑郁表型，对抗抑郁药敏感性降低基因工程小鼠