采用基因芯片筛选肝癌转移相关基因的研究

中国临床肿瘤学教育专辑(2007)405采用基因芯片筛选肝癌转移相关基因的研究第二军医大学东方肝胆外科医院综合治疗一科王葵沈锋施乐华阎振林卫立信丛文铭孟超摘要目的：用人基因表达谱cDNA芯片研究原发性肝癌(HCC)与癌旁正常肝组织的基因表达差异并进行验证。方法：利用含有人5075个基因cDNA的人表达谱芯片，将6例原发性肝癌患者分为伴和不伴门静脉癌栓两组(A组和B组，每组n=3)，分别取癌组织、癌栓组织和癌旁正常肝组织，分别抽提总mRNA,反转录为cDNA与芯片进行杂交，对比mRNA表达的差异。在差异表达的基因中，选取9个基因在41例肝癌病人癌和癌旁正常肝组织进行RT-PCR实验验证其表达情况。结果：癌组织及癌栓组织与癌旁正常肝组织比较，伴门脉癌栓组(A组)癌组织与不伴门脉癌栓组(B组)癌组织中上调表达基因分别有169和170个，两组下调表达基因分别有349和364个，其中两组共同上调表达基因中135个，共同下调表达基因305个。两组癌组织分别表达上调和下调的基因之中，表达明显上调的基因(ratio3)无癌栓组有3个、癌栓组有5个，而明显下调的(ratio0.4)无癌栓组有4个、癌栓组有10个。分别挑选两组癌组织共同高表达基因(ASPH)、共同低表达基因(MT1X)、有癌栓组高表达基因(FACL4、POSTN、MAP4K4、HSF1、UCHL1、DAP3、IARS)共9个，在41例HCC病人组织和四种肝癌细胞系中进行RT-PCR检测，其中ASPH、MT-1X、MAP4K4、FACL4、DAP3、HSF1在癌组织中的表达与癌旁组织比较有显著差异或有差异(P＜0.01或P＜0.05)。结论：基因表达谱cDNA芯片是检测肝癌差异基因表达的有效方法，其基因变化可以进一步在RT-PCR中证实。ASPH、MAP4K4、FACL4、DAP3、HSF1和MT-1X在癌组织中表达明显高于和低于癌旁组织，在肝癌细胞系中表达亦增高和降低，但在41例标本中表达变化与伴或不伴门静脉癌栓相关性不明显。关键词cDNA芯片；肝细胞肝癌；门静脉癌栓；基因表达谱GeneExpressionProfileAnalysisinHumanHepatocellularCarcinomapredicttheriskformetastasisusingcDNAMicroarrays.WANGKui1,SHENFeng1,SHILe-Hua1,WUMeng-ChaoDepartmentofComprehensivetreatmentI,EasternHepatobiliarySurgeryHospital,Shanghai200438)AbstractObjective:Tostudythedifferenceingeneexpressionbetweenhepatocellularcarcinoma(HCC)withandwithoutportalveintumorthromosis(PVTT).Methods:Polymerasechainreaction(PCR)productsof5075humangeneswerespottedonachipinarray.cDNAswerethenfixedonaglassplate.TotalRNAwasisolatedfromfreshlyexcisedhumanHCCwithPVTT(groupA,n=3)andHCCwithout(groupB,n=3)tissues,andwasreverselytranscribedtocDNAswiththeincorporationoffluorescentdCTPforpreparationofhybridizationprobes.ThemixedprobeswerethenhybridizedtothecDNAmicroarray.Afterhighlystringentwashing,cDNAmicroarraywasscannedforthefluorescentsignalstodisplaythedifferencebetweenthetwokindsofHCC.TheresultsofamicroarrayhybridizationexperimentfromsixdifferentHCCtissueswereanalyzedandclassifiedbytheClusterprogram.Amongthesedifferentially-expressedgenes,selectedninegenesandthedifferentialexpressionofthesegeneswasfurtherconfirmedbyanRT-PCRanalysis.Theaspartateβ-hydroxylase/aspartylβ-hydroxylaseASPH,wereup-regulated;theMT-1Xweredown-regulatedinHCC;theFACL4,POSTN,MAP4K4,RRM1,HSF1,UCHL1,DAP3andIARSwereup-regulatedinHCCwithPVTT.ThedifferentialexpressionofthesegeneswasfurtherconfirmedbyanRT-PCR406中国临床肿瘤学教育专辑(2007)analysisof41HCCsand4hepatocytes.Result:Totally518differently-expressedgeneswereidentifiedintumorandPVTTtissuesofHCCwithPVTT，534differently-expressedgeneswereidentifiedintumortissuesofHCCwithoutPVTT.Theespeciallyup-regulatedgenesofgroupAandgroupBwere39and35(ratio2).Theespeciallydown-regulatedgenesofgroupAandgroupBwere59and46(ratio0.5).Theespeciallyup-regulatedgenesofgroupAandgroupBwere3and5(ratio3).Theespeciallyup-regulatedgeneswere4and10(ratio0.4).Amongthesamplesfrom41HCCpatientsstudies,themRNAexpressionsofASPH,MT-1X,MAP4K4,FACL4,DAP3andHSF1weredifferentinHCCandadjacentnormalliver.(P＜0.01).Conclusion:Thequickandhigh-throughoutmethodofprofilinggeneexpressionbycDNAarrayprovidesuswithanoverviewofkeyfactorsthatmaybeinvolvedinhepatocellularcarcinomawithandwithoutportalveintumorthromosis,andmayfindthecluetothestudyofhepatocellularcarcinomawithPVTTcarcinogenesisanddevelopement.FurtheranalysisofthesegeneswillhelptounderstandthedifferentmolecularmechanismsofHCCwithPVTT.KeyWordshepatocellularcarcinoma;portalveintumorthromosis;cDNAMicroarray;geneexpression原发性肝癌(PrimaryLiverCancer)是世界上主要恶性肿瘤之一，在我国恶性肿瘤中死亡率长期位居前二位，死亡率高达20.4/10万，每年约占全世界肝癌死亡人数的一半。[1，2]尽管我国在原发性肝癌的临床诊治方面取得令人瞩目的成就，但是目前的现状仍不容乐观，影响疗效的主要因素是转移复发[3，4]。因此，为提高肝癌患者的生存率、降低转移复发率，需要加强对肝癌分子病理机制的研究、寻找新的有效治疗靶点和探讨肝癌肝内转移复发的机制成为肝癌研究的重点。一、材料和方法(一)研究对象1.芯片杂交研究对象：选取肝细胞癌伴门静脉癌栓与不伴门静脉栓患者共6例为研究对象，平均年龄(47±9)岁，分为不伴癌栓组(A组，n=3)和伴癌栓组(B组，n=3)，同时各自以其癌和或癌栓组织为处理组、癌旁组织为对照组。2.半定量RT-PCR研究对象：41例2004年10月至2005年6月间在东方肝胆外科医院经外科手术切除及病理证实的肝细胞癌患者标本。SMMC-7721、MHC、HepG2四株肝癌细胞。3.取材方法：取手术中切除的新鲜标本，术中待肿瘤切除和门静脉癌栓取出后立即取材，取癌、癌旁、癌栓组织，离体30分钟内液氮保存。门脉癌栓取距离主瘤远侧端，相邻无瘤肝组织取距离主瘤尽可能远(2cm以外)者。4.细胞培养方法：HepG2、Hep3B、SMMC-7721均用DMEM，10%FBS培养，置37度，5%CO2孵箱培养，保持饱和湿度。(二)cDNA芯片实验方法1.cDNA芯片的制备：从生物芯片上海国家工程研究中心基因库中取5000余个人功能基因克隆，经过体外扩增，得到大小和序列不同的cDNA片段，经过纯化后，利用机械手将它们高速有序地点样，固定在1.8×1.8cm玻片上，从而制备成高密度微阵列，人5K基因表达谱CDNA芯片V1.0，共有5075条基因；另外有10个阳性对照基因和5个阴性对照基因或样品，每个点重复48次。中国临床肿瘤学教育专辑(2007)4072.RNA的抽提：组织样品，经过Trizol法抽提组织RNA；定量后，琼脂糖检测，RNAeasykit纯化RNA，后经过确认RNA质量后继续后续实验。3.RNA的标记和分子杂交实验标记方法采用cDNA直接标记法，其中处理组RNA采用cy3荧光标记，对照组RNA采用荧光cy5标记。然后利用等量的探针进行杂交，杂交方法采用42℃，16小时杂交，并在55℃洗片。4.信号扫描和分析芯片结果采用Agilent扫描仪进行扫描，软件读取数据，分辨率Scanresolution为5μm，PMT100%，最后采用Genespring进行Normalize处理分析，最后ratio值为cy3/cy5，即处理组/对照组。差异基因筛选标准为ratio或=2为上调基因，ratio或=0.5为下调基因。(三)RT-PCR实验方法1.RT-PCR引物(表1)表1检测基因的引物序列基因名称引物序列产物长度ASPH5'-ATCTGTCTGGCAACGCTCA-3'442bp5'-ACATCGAATCTTGCAGCCT-3'β-actin5′-ACCATGGATGATGATATCGC-3′386bp5′-ACATGGCTGGGGTGTTGAAG-3′FACL45′-AAGGAAGCAAAGGAGACTGTA-3′442bp5′-TCTTGCCAGTCTTTTAGCTTA-3′HSF-15'-TACAGCAGCTCCAGCCTCTACG-3'316bp5'-TGGCGTCCGTGAGGGCTGTGAC-3'IARS5'-TCCTGCTTGAAAACCCACTT-3'113bp5'-TAATTTCCTGCGTTTGGGTC-3'DAP35'-GCACTTGTTCACAACTTGAG-3'260bp5'-TCTGTAGGAGCTTTCTCATG-3'MT-1X5'GCAAATGCAAAGAGTGCAAA3'315bp5'GAAGAAGGCTGCATCAGGAG3'POSTN5'-GACTCAAGAT