植物细胞培养

第五讲植物细胞培养PlantCellCulture第一节植物细胞培养简介一、概念：在培养基中培养彼此分离的细胞、使之生长、增殖或分化。二、类型：1、固体培养(solidculture)：在固体培养基中培养细胞=静止培养。细胞被固定、不能移动;单细胞分裂后形成细胞团优缺点:1）所得到的各个细胞团均为单细胞形成，遗传成分和生理特性具有一致性；2）细胞生长速度较慢；3）不能长期、连续、大规模培养细胞。2.液体培养（liquidculture）：在运动的液体培养基中培养细胞。又称悬浮细胞培养（suspensioncellculture）。细胞是分散的，可以长期培养。有2种形式：成批培养(batchculture)：一个容器的细胞培养结束后，细胞被转移到新的容器中继续培养。连续培养(continuousculture)：在一个容器（或者系统）中连续不断的培养植物细胞。成批培养连续培养悬浮细胞培养的特点1）细胞生长速度较快；2）可以长期、连续、大规模培养细胞；3）不能跟踪单细胞的分裂和生长过程。三、细胞培养的应用1.进行细胞生物学研究：通过适当的培养技术，人们可以连续观察和记录（摄像）单个细胞的生长、分裂和分化的全过程。因此，细胞培养技术是研究细胞生长、分裂和分化的良好实验体系。如某个或某种类型的植物细胞是怎样生长、分裂和分化的？化学物质（激素等）或者物理因素（重力、压力）等是怎样影响这些过程的？细胞培养证明了植物细胞全能性2.培育植物变异体：有变异，才会有选择人们总是希望获得具有某些抗性的品种，如抗病、抗虫、抗盐碱、抗铝、抗除草剂等。（1）从自然变异的植株中进行选择：自然变异率低、机会小，工作量大，效率低。（2）杂交育种：可以把抗性基因转移到需要改良的品种中，但时间长（3）诱变植物（种子或芽）：工作量大（4）细胞培养：效率高。先诱变细胞，再将细胞培养在有选择压力的培养皿中，具有抗性的细胞就可以分裂，诱导其形成完整植株，即可获得抗性变异体。在一个培养皿中，一次可以筛选10-20万个细胞（一个细胞就是一潜在的植株）。3.生产有用化合物：利用大规模细胞培养技术可以在室内生产一些植物细胞合成的有用物质，如色素、香料、药物成分等。第二节细胞培养的建立、维持和生长特点一、细胞培养的建立和维持细胞培养通常是将植物材料接种在液体培养基中，经过摇荡建立起来的。外植体液体培养振荡培养上清液愈伤组织液体培养继代培养振荡建立起来的悬浮细胞必须适时进行继代培养。继代培养（传代培养；subculture）：将培养物（芽、愈伤组织、细胞等）分成若干份，接种到新鲜培养基上继续增殖的过程。愈伤组织(callus)是一群无明显组织分化、有分裂能力的细胞群（团）。有多种类型，在颜色、松散程度、含水量、生长速度等方面存在差异。形成的因素：创伤或（和）植物激素的诱导分化(differentiation)——形态、结构和功能相同的细胞变成形态、结构和功能互不同的细胞的过程，如分生组织细胞转变成薄壁组织、维管组织、厚壁组织等。脱分化(去分化；dedifferentiation)——已分化、成熟的细胞失去原有的状态、重新恢复分裂能力的过程。外植体形成愈伤组织的过程就是脱分化的过程。再分化(redifferentiation)——愈伤组织形成其它组织或器官的过程二、悬浮细胞的生长过程1.悬浮细胞生长的特点细胞培养周期：两次继代培养所间隔的时间。在一个细胞培养周期中，细胞的生长情况经历了慢—快—慢的过程（下图）。细胞生长曲线051015202503691215182124273033363942培养时间（天）细胞生长量（g/瓶）延滞期快速生长期静止期下降期渐降期云南红豆杉细胞生长曲线延滞期：细胞继代培养开始后的一段增殖缓慢的时间。快速生长期：细胞数量、重量或体积直线上升的时期。对数生长期渐降期：细胞生长速度逐渐减慢的时期。静止期：新生的细胞数量与死亡的细胞数量达到动态平衡的时期。下降期：活细胞数量不可逆下降的时期。0.02.55.07.510.012.515.017.520.022.525.003691215182124Culturedaysg/LsucrosecellDW云南红豆杉细胞生长和蔗糖消耗动态蔗糖浓度细胞干重细胞悬浮培养要求达到一定的接种细胞密度(cells/ml)，一般为0.5-2.5×105个细胞/ml。密度高，细胞分裂快，延滞期短；密度低则相反。如果密度太低，则细胞不能不分裂，最后全部死亡。因此，悬浮细胞培养时，要求达到最低起始细胞密度（minimuminitialcelldensity）。最低起始细胞密度:细胞能够生长、分裂的最低接种密度。影响最低起始细胞密度的因素(1)植物种类：生长快、容易培养的植物（如大多数草本植物），其最低起始细胞密度比较低；相反，则高。(2)细胞的生理状况：用快速生长期的细胞接种，则起始细胞密度可以比较低。(3)培养基成分：用营养成分丰富的培养基或条件化培养基(conditionedmedium)培养细胞，起始细胞密度低。条件化培养基:培养过几天高密度细胞后的无细胞培养基(4)培养方式：采用看护培养（nurseculture）是降低最低起始细胞密度的有效方法之一。看护培养（nurseculture）：将亲本愈伤组织或高密度的悬浮细胞同低密度细胞一起培养，以促进低密度细胞生长、分裂的培养方法。NurseCulture（微孔滤膜）低密度细胞高密度细胞透析袋第三节单细胞培养技术单细胞培养是培养彼此分离的单个细胞,是研究和观察细胞生长与分裂过程的有效方法。单细胞培养常用的方法：微室培养和平板培养。一、微室培养(Cultureinmicrochamber)微室培养是在悬滴培养的基础上发展而来的。1955年DeRopp把含有细胞的液体培养基滴在玻璃板上以观测单细胞的生长。但他没有发现单细胞分裂，发生分裂的是含有几个细胞的小细胞团。1957年，Torrey改进了培养方法，采用微室培养。利用此培养技术培养豌豆根尖单细胞，得到了含几个细胞的细胞团。1960年，Jones用条件化培养基在微室中进行悬滴培养烟草杂种细胞，得到了含30个细胞的细胞团，并用录象记录了细胞分裂的全过程。微室载波片石蜡固体培养基和愈伤组织单细胞二、平板培养（Plateculture）1960年Bergamann首创，是在固体培养基中培养大量单细胞的一种方法。1.单细胞悬浮液的制备：（1）用不锈钢滤网（150μm)过滤快速生长期（旺盛分裂）的悬浮细胞，得到单细胞滤液；（2）滤液经过离心后，细胞沉淀；（3）倒出上清液，用新鲜培养基重新悬浮细胞，并调节细胞密度（视最终接种密度和固体培养基混合的比例而定；一般5×103-5×105cell/ml）步骤：细胞悬浮液与固体培养基混匀后，倒平板2.培养基制备配制固体培养基，但浓度要比正常的高（与稀释倍数有关），高温灭菌后冷至35-40℃。条件化培养基的配制：培养悬浮细胞的培养液离心取上清液与高温灭菌的培养基等量混合冷至35-40℃备用。3.平板培养的制作：将单细胞悬浮液按预定的比例与35-40℃固体培养基混合均匀后，倒入无菌培养皿中，培养基的厚度为5mm左右。盖上盖子，摇动、布匀，用Parafilme膜封口后，进行培养。（或放入垫有湿润无菌滤纸的大培养皿中，以防水分的蒸发过快）。4.培养条件：温度为25℃，黑暗或弱光照。平板培养的效果，可用植板率（plateefficiency）来衡量。植板率（%）=每个平板中新形成的细胞团数/每个平板中接种的细胞数×100影响植板率的因素(1)植物种类：生长快、容易培养的植物（如大多数草本植物），其植板率高；相反，则低。(2)细胞的生理状况：用快速生长期的细胞接种，则植板率高。（3）接种细胞密度：接种密度高，有利于细胞分裂，提高植板率，如烟草细胞。烟草细胞接种密度和植板率接种密度（cell/ml）植板率(%)9001809.936045.772090-100接种密度过高，会使细胞团之间相互靠近、接触，这不仅造成计数困难，而且无法判断细胞团的归属，不利于细胞系克隆（clone）的选择。(4)培养基成分：用营养成分丰富的培养基或条件化培养基，植板率高。(5)培养方式：采用看护培养（nurseculture）是可以提高植板率。平板培养是分离、筛选单细胞无性系的有效方法第四节植物细胞大规模培养生产次生代谢物质ProductionofSecondaryMetabolitesbyLarge-scaleCultureofPlantCells一、植物次生代谢和次生代谢产物（一）次生代谢和次生代谢产物初生代谢：为维持植物正常的生长发育所必须的代谢，如呼吸作用、光合作用、蛋白质和氨基酸代谢、核酸和核苷酸代谢、脂肪代谢、激素代谢等。初生代谢产物：初生代谢过程中形成的各种产物。初生代谢产物不稳定，在体内容易发生转化。次生代谢：对植物正常的生长发育非必需的代谢，其代谢产物称为次生代谢产物。次生代谢是在初生代谢基础之上衍生而来的。次生代谢产物为小分子有机化合物，其产生和分布通常有种属、器官、组织以及生长发育时期的特异性，也往往是末端代谢产物，比较稳定，可以在体内积累。植物次生代谢产物种类繁多，已经分离、鉴定的有10万个左右，按结构特点可分为苯丙素类、醌类、黄酮类、单宁类、萜类、甾体及其甙、生物碱七大类。详细情况可参阅《中药化学》、《天然产物化学》等书。OOOOOCH3CH3OOCH3HHHHO鬼臼毒素（抗肿瘤）苯丙素类水飞蓟素：治疗急、慢性肝炎、肝硬化、中毒性肝损伤等）的良药。OOOHOOHOHOCH3CH2OHOH苯丙素类CH3CH3COOHOCHCH2CHHOHO天然色素，绛红色。抗菌、抗炎、抗病毒、止血。用于化妆品生产紫草紫草根紫草素醌类芦丁、槲皮素：治疗心脑血管疾病药物的主要成分。OOOHHOOHOROH槲皮素R=H芦丁R=芸香糖银杏黄酮、大豆黄酮：预防心血管疾病黄酮类CHCHCH3OHNHCH3麻黄碱：止咳平喘N+OOOCH3OCH3OH-小檗碱：抗菌消炎NCH3OCHNCHCH2OH奎宁：抗疟疾生物碱：来源于生物体的一类含氮有机化合物。多具有显著生物活性。罂粟=鸦片主要产地：金三角地区（缅甸、老挝、泰国）、阿富汗、巴基斯坦、南美NOHHOOH3C吗啡镇痛作用鸦片：含丰富的吗啡、可待因等生物碱药物：镇痛毒品：麻痹、毒害神经、破坏免役力，容易成瘾海洛因：由吗啡合成的二乙酰吗啡长春花ajmalicine阿吗碱:$2000/kgVinblastine长春碱:$2million/kgVincristine长春新碱:$15million/kg阿吗碱长春碱长春新碱OHOOOHHAcOOOAcOBzOOHC6H5NOC6H5H紫杉醇(Paclitaxel=Taxol)紫杉醇的发现50年代末-60年代初：癌症病人大量增加60年代中期：美国食品与药物管理局（FDA）制定计划，广泛寻找、筛选治疗癌症的药物（动物、植物、微生物）1969:美国农业部（USDA）采样员在Oregon洲采取到太平洋紫杉（pacificyew，短叶红豆杉）树皮，后经筛选试验发现有强烈的抑制肿瘤的作用红豆杉(Taxus)：明星植物，药物黄金JournalofAmericanChemistrySociety1971May5;93(9):2325-23257.Plantantitumoragents.VI.Theisolationandstructureoftaxol,anovelantileukemicandantitumoragentfromTaxusbrevifolia.WaniMC,TaylorHL,WallME,CoggonP,McPhailAT1971年：美国北卡州的三角化学研究所的化学家成功地分离出活性物质，起名紫杉醇，并发表了它的化学结构。没有申请专利保护1970’S:紫杉醇有很好的治疗癌症但临床实验导致1人死亡，FDA否定了紫杉醇1979：爱因斯坦医学院博士后Susan在Science上发表了紫杉醇抗肿瘤机理，重新激起人们对紫杉醇的兴趣。198