植物细胞培养的技术

植物细胞培养的技术闫超姜玮马可植物细胞培养的技术•一、植物材料的准备•二、培养基制备•三、培养方法选择一、植物材料的准备用于植物组织培养的外植物必须是无菌材料，因此培养前必须对外植物进行严格的灭菌处理。如果含有其他微生物，在培养基中，其他微生物会大量迅速繁殖从而影响植物组织的培养。灭菌剂选择的原则：尽可能的选择那些灭菌后易于除去的试剂。灭菌剂的原则和处理时间的长短取决与所选材料对试剂的敏感性，敏感的外植物体的灭菌时间不宜过长。常用灭菌剂有次氯酸钙、次氯酸钠和氯化汞。次氯酸钙为工业漂白粉过滤后的饱和溶液，适用于草本植物和柔软组织的灭菌处理，时间为5-30min。氯化汞灭菌效果好，但不易除去，时间不易过长，以免杀死植物细胞，当其用于休眠种子的灭菌剂最为理想，适用浓度为0.1%，2-10min，种子皮较厚时可延长至20min以上。二、培养基及其组成•培养基实际上是植物离体器官、组织或细胞的“无菌土壤”，其特点是营养成分的可调控性。•植物细胞或组织培养基常含有无机盐、碳源、有机氮源、植物生长激素、维生素等成分。必需营养物是否加入、浓度的高低、各族非得相对浓度等都会对培养结果产生重大的影响，甚至起至关重要的作用。•MS培养基和LS培养基应用最广。1、无机盐•分为大量元素和微量元素，30mg/l界限，大量有氮、硫、磷、钾、镁、钙、氯、钠。微量有铁、锰、碘、钼、铜、锌。某些情况下，还可加入镍、铬或铝。•磷以磷酸盐的形式存在，浓度在1.1~1.25mmol/l，磷的消耗很快与其他成分相互作用而被消耗殆尽，但机体自身可产生磷可满足需要。•大多数氮常以铵盐或硝酸盐形式提供。•钾、镁、钙、离子对细胞代谢必不可少，镁离子参与多种辅酶和激活子的合成；钾离子、钙离子可抑制某些酶的活性，有时钙离子也可保持某些酶的活性或稳定性。微量元素的作用是参与辅酶的形成，并可诱导酶的合成2、碳源•植物细胞培养物通常为异养细胞。人们常用碳源为碳水化合物、肌醇、甘油、乳糖和半乳糖。有时培养基固化物（如琼脂）也作为碳源。•有些通过同化二氧化碳而获得全部能量，即光自养培养物。•天然提取物如椰子乳、对愈伤组织的诱导和培养也有重要意义。3、植物生长调节剂•植物激素是植物代谢过程中形成的生长调节物质，在极低浓度（1μmol/l）时即能调节植物的生育过程，并能从合成部位转运到作用部位而发挥作用。•植物激素只限于天然产生的调节物质。常见的植物激素有生长素、分裂素、赤霉素、脱落酸、乙烯。•愈伤组织或细胞的生长和生存依赖于合成的生长素或天然生长素，可诱导特异酶类，包括与RNA合成有关的酶。•植物组织和细胞培养物的生长过程主要取决于生长素和分裂素的比例，比值高可刺激细胞分裂，比值低则刺激细胞生长。但过量的赤霉素或酚类化合物可掩盖上述现象。对于植物培养细胞，绝大多数培养基中都必须加入一定量的生长调节剂。4、有机氮源•植物组织和细胞培养中常用蛋白质水解物或各种氨基酸，有机氮源对细胞的早期生长有利，氨基酸的加入主要是为了代替或增加氮源的供应。•但注意苏氨酸、甘氨酸和缬氨酸可通过灭活位于叶绿体和细胞质上的谷氨酸合成酶而降低氮的利用，而精氨酸通常具有补偿此灭活作用的能力。5、维生素•植物细胞通常是维生素自养型，但大多数不能满足自身的需要。对大多数培养基而言，除了加入b族维生素（如B1、B2和泛酸）外，还加入定量的生物素和肌醇，后者构成磷脂肌醇极性端的组分。（细胞膜部分含磷脂肌醇2%~8%）三、培养方法•培养对象：原生质体培养和单倍体细胞培养等•培养基类型：固体培养和液体培养•培养方式：悬浮细胞培养和固定化细胞培养固体培养•包括利用琼脂作为支撑物的固体培养和固定化细胞培养•特点：简便易行、培养所占空间少。•缺点：愈伤组织生长不平衡；阻碍组织呼吸、堆积有害物质；细胞间极化现象；测定生理生化指标时会改变其形态生理状态•最常用的固化剂：琼脂•一般温度保持为（25±1）℃•固体培养和液体培养互相配合仍是组织（细胞）培养的常规操作。•外植体在培养三周左右必须移至新鲜培养基上，以保持继续生长。移换一次培养基称为一次继代培养，经过一定次数的继代培养，愈伤组织变得较为疏松时，方可进行悬浮培养。液体培养•包括：小规模的悬浮培养和大规模的成批培养、半连续和连续培养。悬浮培养•分为静止和振荡两类•静止液体培养具有简便易行的特点，还不会出现营养物质浓度差的现象。●振荡液体培养，使悬浮细胞在液体培养基中，不断振动下进行培养。可以克服静止培养的许多缺点。成批培养法•将培养基一次性加入反应器中，接种、培养一定时间后收获细胞的操作方式。•反应器：气升式反应器•方法：两步培养法•气升式反应器：培养过程用通气代替搅拌，避免了使用机械搅拌所致的细胞破碎、通气受限制、培养物易被污染等缺点，细胞产量也明显高于机械搅拌式生物反应器。•两步培养法：使用两个反应器。第一个用于细胞生物量的累积，第二个用于次级代谢产物的生产。5L气升式植物细胞（或器官）培养罐半连续培养法•在反应器中投料和接种培养一段时间后，将部分培养液和新鲜培养液进行交换的培养方法。连续培养法•利用连续培养反应器，在投料和接种一段时间后，以一定的速度连续采集细胞和培养液，并以同样速度供给新鲜培养基以使细胞生长环境维持恒定。•优点：细胞的生产能力高•缺点：细胞生长慢，培养时间长，要严格保障系统的无菌状态。•在培养特定细胞或生产次级代谢产物时，采用二阶段连续培养法。二阶段连续培养•第一罐中投入适于细胞增长的培养基（即生长培养基）并连续加入该培养基，第二罐中投入适于产生次级代谢产物产生的培养基（即生产培养基）固定化培养法•固定化反应器有网状多孔板、尼龙网套和中空纤维膜等多种类型。将细胞固定在尼龙网套内或固定于中空纤维膜反应器的膜表面，或固定于网状多孔板上，放在培养液中进行培养，或连续通入新鲜培养基，进行连续培养又连续收集细胞，可通入净化空气代替搅拌。•固定化的优点是细胞位置固定，易于获得高密度细胞群体和维持细胞间的物理化学梯度，利于细胞组织化，易于控制培养条件及获得次级代谢产物。