植酸酶

植酸酶的生产及应用植酸酶的性质•植酸酶是一种能水解植酸为肌醇和磷酸的一类酶的总称，它具有特殊的空间结构可将植酸磷(六磷酸肌醇)降解为肌醇和无机磷酸，属于磷酸单酯水解酶。是胞外酶。•其分子量因来源不同存在很大差异，这主要是由于糖基化的原因造成的。植酸酶基因在不同的表达系统中,糖基化程度不一样。植酸酶的理化特性•最适PH：植酸酶的最适pH值一般在2～6之间。植物来源的植酸酶最适pH为4.0～7.5,大多数在5.0～6.0。细菌来源的植酸酶最适pH一般为中性或偏碱性。真菌植酸酶为2.5～7.0。最适温度：植酸酶最适温度在40～60℃范围内。植酸酶的理化特性•激活因子与抑制因子多数二价阳离子(Ca2+、Fe2+、Zn2+、Mg2+、Cu2+等)因与底物(植酸)发生强烈的络合作用而抑制酶的活力。草酸、柠檬酸等化合物也因与酶活性中心关键氨基酸的侧链基因反应而降低酶活,常见的底物竞争性抑制剂等的出现也会对酶的作用效果产生不利的影响。对于有的植酸酶,则存在某种特定的金属离子可以作为电子转移载体起到酶的激活剂的作用,如Fe2+激活酿酒酵母,Ca2+激活枯草杆菌植酸酶等等。植酸酶催化机制胍基中的正电荷直接与底物植酸的磷酸基团相互作用，使其对亲荷攻击更敏感。在共价连接的磷-组氨酸中间物中，组氨酸残基作为亲荷物质。C-末端序列HD的天门冬氨酸残基提供质子给底物，释放磷。杆状菌植酸酶催化机制存在特殊性，其稳定性与活性依赖于Ca2+。杆状菌植酸酶催化机制•植酸通过双降解途径产生三磷酸肌醇。•途径一：酶依次从3-位和1-位将磷酸盐水解下来，将第一个磷水解后，酶与底物分离，然后底物再结合到酶的活性位点水解第二个磷，产生中间物2,4,5,6-四-磷酸肌醇，再将5-位磷水解下来，得到产物2,4,6-三-磷酸肌醇。•途径二：首先是依次将6-位和4-位的磷水解，得到的中间产物1,2,3,5-四-磷酸肌醇释放后，再与酶结合，将2-位磷水解，得到终产物1,3,5-三-磷酸肌醇植酸酶高产菌株选育目前，植酸酶生产主要是利用微生物发酵。由于天然菌种的植酸酶产量较低，无商业利用价值。目前都是以天然菌株进行改良获得的改良菌或通过基因工程技术获得的基因工程菌。MarisaK.Che-lius等用紫外照射法对无花果曲霉Asp.ficuum(NRRL31155)菌株进行改良,获得的突变菌株其植酸酶产量为野生型的3.3倍。此外，可以直接从自然界筛选、亚硝基胍处理、复合处理、钴照射诱变等方法获得高产菌株。植酸酶高产菌株选育实例从自然界筛选高产菌株：（1）、初筛采集各地土壤样品各取10g溶于50mL生理盐水，80℃煮沸8min，菌液稀释涂布于初筛平板。挑取产生较大水解圈的菌落，再次划线分离，将单菌落保存于斜面培养基。（2）、菌种复筛挑取斜面菌落，经种子发酵培养，用偏钒酸铵法测定植酸酶活力。挑选活力最高的菌株，保存。植酸酶高产菌株选育实例（3）种子培养活化甘油管保存菌种，接种于种子培养基。种子培养条件为50mI/250mL，温度37℃，摇床转速160dmin，培养时间24h。（4）摇床发酵培养按8%接种量接种，培养条件为50mL/250mL，温度34℃，摇床转速160r／min，培养时间72h。植酸酶高产菌株选育实例5)、酶活测定制作定磷标准曲线。取发酵液10mL，4000r/min离心15min去菌体,10倍稀释：取0.1mL稀释液+1.9mLTris—HCI(p7．5)+4mL植酸钠(2mmo1/L)，55℃反应30min，再加入4mL反应终止液。显色10min。4000r/min离心10min。波长415nm处测定OD值。植酸酶高产菌株选育实例（6）、菌种鉴定菌落形态观察和生理生化鉴定（参照《伯杰士细菌鉴定手册》）分子生物学鉴定提取细菌基因组，根据16SrDNA中最保守序列设计引物。进行PCR，产物1%琼脂糖凝胶电泳，产物测序，与Genebank中进行Blast比对，下载同源性最高的菌株16SrDNA序列，采用N-J算法，用Mega软件构建系统发育树。植酸酶生产•巴斯德毕赤酵母表达系统是目前最优秀、应用最广泛的外源基因表达系统之一。它不但克服了大肠杆菌表达系统不能表达结构复杂的蛋白质，表达的蛋白多形成包涵体，背景蛋白多，表达量不很高等缺陷，还具有与真核生物极其相似的分泌途径和很强的真核蛋白质修饰功能，并且其自身分泌的蛋白质很少且易于高密度发酵，因此，在表达和分离纯化异源蛋白质等方面具有很强的优势。植酸酶发酵生产植酸酶发酵包含固态发酵和液态发酵。固态发酵是以麸皮、玉米淀粉、黄豆饼粉等农副产品或加工废弃物，如稻草、米糠等为主原料，微生物此时发酵环境接近于自然状态下的微生物生长习性，产生的酶系更全。固态培养设备比较简单、成本低、产生的废弃物少、易推广，但放大比较困难、培养参数控制较复杂、易染菌，而且生产的酶难于分离纯化。植酸酶发酵生产液态发酵液态发酵培养条件易于控制，不易污染杂菌，生产效率高。目前植酸酶的工业化生产主要采用液态发酵工艺。植酸酶的应用植酸酶不仅可以解除植酸的抗营养作用,提高食物和饲料中多种矿物元素和蛋白质、氨基酸的可利用性。而且能够降低粪便排泄磷造成的环境污染,是一种新型的绿色饲料添加剂。植酸酶应用包含以下几个方面：1、在饲料工业上的应用2、在食品工业的应用3、在医学上的应用1、植酸酶在饲料工业上的应用1.1提高磷及其它矿物元素的生物利用率日粮中添加微生物植酸酶，磷的利用率可以提高30%～50%。同时能增加钙镁、锌、锰、铜和铁的生物利用率，促进了动物矿物质营养的平衡，进而导致动物组织结构改善。1、植酸酶在饲料工业的应用1.2促进动物对蛋白质、氨基酸及碳水化合物的消化吸收从理论上讲，植酸酶水解植酸释放磷的同时，可以将与植酸络合的蛋白质释放出来，便于消化道分泌的各种蛋白酶作用同时还可以释放与植酸结合的内源性蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等，从而使消化利用率提高。1.3提高动物的生产性能，提高总能利用率2、植酸酶在食品工业的应用2.1改善人体对矿物质的吸收2.2提高食品加工技术许多主要的食品原料，如：豆类、谷物和油料作物中抗营养因子——植酸的含量很高，由其加工的食品中植酸的含量也很高。在人的小肠中，植酸酶活性极低，难以利用植酸盐。所以在一些食品中添加植酸酶是必要的，可提高其营养价值。3、植酸酶在医学上的应用植酸的降解产物之一以1，2，6-IP3、1，2，3-IP3和1，3，4-IP3等几种异构体为主的三磷酸肌醇（IP3）具有广泛的生理功能。此外，植酸酶还有其它用途，如开发植酸酶菌肥，循环利用土壤中有机磷；还可用于谷物沉淀加工废弃物的处理和玉米的湿磨加工。植酸酶生产应用中存在的问题植酸酶生产应用的主要难题是其耐热性问题。现有的用于商品化的植酸酶虽然具有较强的耐热性，但在70℃下制粒试验表明，其活性损失25％，80℃以及更高的温度使酶活损失更大，而高温制粒和高温消毒是现代饲料工业中常用的加工工艺。另一方面，饲料用酶又必须在常温下具有较高的酶活性，因为饲料用酶最终的作用场所在动物的肠道中，一般在37℃左右，现有的植酸酶通常都存在这样一种矛盾，即耐热性好但在37℃时酶活不高，或者是37℃时酶活高却不耐高温。植酸酶生产应用中存在的问题利用转基因植物生产植酸酶以微生物作为转化受体生产植酸酶存在以下缺点：第一，微生物发酵需要庞大的设备投资和高成本的培养基第二，原核生物不能对表达产物进行准确的翻译后加工及蛋白质的糖基化第三，通过微生物发酵生产的植酸酶能让动物感染病原体参考文献：1.马俊孝.饲用植酸酶的研究进展[J].饲料工业,2010,31(16).2.李晓宇，陈耀国，柳志强.植酸酶生产与应用的研究进展[J]-中国农学通报，2011,27（03）：257-261.3.张若寒.饲用植酸酶应用技术现状及生产企业面临的挑战与机遇[J]-专家论坛，2008,44（06）.4.于平，陈益润.土壤中高产植酸酶芽孢杆菌菌株的筛选及鉴定[J]-中国食品学报，2010,10(06).5.贺建华.植酸磷和植酸酶研究进展[J]-动物营养学报，2005,17(01).6.姚斌，范云六.植酸酶的分子生物学和基因工程[J]-生物工程学报，2000,16(01).7.龙跃，杨博，王永华，等.植酸酶的高密度发酵、制备及其应用研究[J]-饲料工业，2010,31(20).8.汪世华，吕茂洲，等.植酸酶的现状及其研究进展[J]-广州食品工业科技，2010,1（18）.谢谢！制片人：杨娇、陈丹丹、柯荣华、曹亚飞