第十三章 生物技术在植物育种中的应用

第十三章生物技术在植物育种中的应用1、教学的基本要求（1）了解细胞工程与作物育种的原理和基本方法；（2）了解作物的转基因技术的原理和基本方法；（3）了解分子标记的主要类型和分子标记辅助选择育种的原理和基本方法。2、教学基本内容第一节细胞工程与作物育种一、细胞和组织培养与作物育种二、植物原生质体培养和体细胞杂交第二节作物育种的转基因技术一、转基因技术的发展现状二、*转基因育种的程序三、转基因作物品种的选育四、转基因作物的生物安全性第三节分子标记辅助选择育种一、*分子标记的类型和特点二、常用分子标记的原理和遗传特性三、MAS育种方法第十三章生物技术在作物育种中的应用第一节细胞工程与作物育种植物细胞工程（plantcellengineering）是以植物组织和细胞培养技术为基础发展起来的一门学科。它以细胞为基本单位，在体外（invitro）条件下进行培养、繁殖或人为地使细胞某些生物学特性按人们的意愿生产某种物质的过程。细胞工程与作物遗传改良有着密切关系，利用细胞工程技术已培育出一些大面积推广的品种。早期，哈布兰特在前人细胞学说的影响下，提出高等植物的组织和器官可以不断分割，并进一步提出了植物细胞全能性（celltotipotency）理论。植物细胞全能性是植物细胞工程的理论基础。细胞全能性是指细胞所具有的形成各种细胞类型的潜在能力，也包括植物细胞经脱分化再形成植株的能力。1904年，Hanning用萝卜的胚培养，获得小植株，为组织培养的工作奠定了基础。1934年，White对番茄切段进行培养，建立了第一个活跃生长的无性繁殖系，获得了离体培养的真正成功。三年后，White又发现B族维生素对培养物的生长有重要作用。经过几年的努力，以White为主的几位科学家建立了植物组织培养（plainttissueculture）的综合培养基，成为以后各种培养基的基础。1948年，Skoog等发现腺嘌呤/生长素的比例是控制芽和根分化的决定因素之一，这一发现成为植物组织培养中控制器官形成的激素模式。Miller（1956）发现激动素比腺嘌呤更能促进芽的形成。1958年，Stewart&Shautz从胡萝卜根的悬浮细胞诱导分化成完整小植株，使50多年前哈布兰特提出的细胞全能性假说首次得到科学验证，这一成果大大加速了植物组织培养研究的发展。1964年，Guha等从曼佗罗花药培养出单倍体植株。1970年，Kameya等利用花粉培养获得单倍体植株。1971年，Takebe等首次从烟草原生质体获得再生植株；1972年，Carlson等获得第一个烟草种间体细胞杂种植株。至此，在愈伤组织水平、单个细胞水平、单个生殖细胞水平、原生质体水平和体细胞杂种水平都获得了完整植株，充分证实了植物细胞的全能性。植物组织培养流程示意图如下。外植体来源→外植体培养→愈伤组织→再生小植株→再生植株植物细胞工程的应用在20世纪60年代就已受到重视，但真正的应用研究在70年代才进入高潮。我国第一个用花药培养育成烟草品种，随后又育成了一些水稻、小麦新品种。经济植物的快繁与脱毒、体细胞变异的筛选、新种质的创造、细胞器的移植、DNA的导入等均对作物改良和农业生产起到了促进作用。一、植物的细胞和组织培养技术（一）培养基及其组成1、培养基（Medium）的种类和特点常用的培养基有MS、B5、White、N6、KM-8p、SH等。2、培养基的成分培养基中都应包括植物生长必需的16种营养元素和某些生理活性物质，通常将这些物质分为三大类，即无机营养物、有机物质和植物生长调节物质（表）。表植物组织培养所需的养分和激素水↑有机物大量元素微量元素PH糖NFeCo↓氨基酸PZnNi维生素KBAl生长素CaMnMo细胞分裂素MgCuI调节物质赤霉素S脱落酸乙烯酵母提取物椰子汁成分不定物质植物提取物水解酪蛋白蛋白胨（二）培养基的配制1、母液的配制为了减少配制培养基时每次称量药品的麻烦，减少极微量药品在每次称重时误差，一般先配制高浓度的储备液，即母液。大量元素可配成10倍母液，使用时每配制1000ml培养基需要从母液中取100ml。配制母液时应做到分别称量，充分溶解，在混合次序上应最后加入Ca2+，混合时要边加边混合。微量元素因为使用量低，一般配成100倍甚至1000倍母液，使用时每配制1L培养基从母液中取10ml或1ml，配制时应注意充分溶解后再依次混合。第三种母液即铁盐，铁盐必须单独配制，若与其它元素混合易造成沉淀。一般采用鳌合铁，即FeSO4与EDTA钠盐的混合物，一般扩大200倍。EDTA钠盐须用温水溶解，然后与FeSO4液混合，在75~80℃之间让其鳌合1h。使用鳌合铁的目的是避免沉淀，并使培养基能缓慢不断地供应Fe+。第四种母液为有机化合物母液，主要是维生素和氨基酸类物质，这类物质不能配成混合母液，一定要分别配成单独的母液，浓度为每毫升含0.1、1、10mg，使用时根据需要量取。最后一种母液是激素，每种激素应单独配制母液，其浓度为0.1、0.5或1.0mg/ml。多种激素难溶于水，配制时应注意溶解次序。IAA、NAA、GA3、玉米素先溶于少量95%酒精，再加水定容；NAA可溶于热水或少量酒精后，再加水定容；2，4-D不溶于水，可用1mol的NaOH溶解后再定容；KT和BA应先溶于少量1molHCl中，然后定容。表一些植物组织培养基的成分（mg/L）-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------成分MS①B5ORWhiteNitschSH②HellerLS③ER-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------大量元素NH4NO31650--1650--720----16501200KNO319002527.51900809502500--19001900CaCl2•2H2O440150------20075440440CaCl2----440--166--------MgSO4•7H2O370246.5370750185400250370370KH2PO4170--170--68----170340NH4H2PO4----------340------（NH4）2SO4--134--------------Ca（NO3）2•4H2O------300----------NaNO3------------600----NaH2PO4•H2O--150--19----125----KCl------65----750------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------成分MS①B5ORWhiteNitschSH②HellerLS③ER------------------------------------------------------------------------------------------------------------------微量元素KI0.830.753.320.75--10.010.83--H3BO36.2324.81.510516.20.63MnSO4•4H2O22.3--89.2525--0.122.32.23MnSO4•H2O--10------10------ZnSO4•7H2O8.6234.4310118.6--ZnSO4•4H2O------------------Zn•Na2•EDTA----------------15Na2MoO4•2H2O0.250.251.0--0.250.1--0.250.025MoO3------0.001----------CuSO4----------0.2------CuSO4•5H2O0.0250.0250.10.010.025--0.030.0250.0025CoCl2•6H2O0.0250.0250.1----0.1--0.0250.0025CoSO4•7H2O------------0.03----AlCl3------------------NiCl2•6H2O------------0.03-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------铁盐成分MS①B5ORWhiteNitschSH②HellerLS③ER--------------------------------------------------------------------------------------------------------FeCl3•6H2O------------1----Fe2(SO4)3------2.5----------FeSO4•7H2O27.8--27.8--27.815--27.827.8Na2EDTA•2H2O37.3--37.3--37.320--37.337.3NaFe•EDTA--28--------1------------------------------------------------------------------------------------------------------------成分MS①B5ORWhiteNitschSH②HellerLS③ER有机物盐酸吡哆醇0.5110.010.50.5----0.5盐酸硫胺素0.110130.010.55--0.40.5烟酸0.5110.0555----0.5肌醇100100100--1001000--100--甘氨酸2----32------2脯氨酸----1381------------叶酸--------0.5--------生物素--------0.05--------蔗糖3%2%3%2%2%3%--3%4%2、培养基的配制以配制1L培养基为例，培养基配制方法如下：⑴混合各成分母液。取大量元素母液100ml、微量元素母液10ml、铁盐母液5ml于一个1L烧杯中，依次加入有机成分和激素，并加水至500ml。⑵熔化琼脂：称7~8g琼脂和所需蔗糖于另一1L烧杯中，加水至500ml，待糖溶解后，加热使琼脂充分熔化。⑶将（1）和（2）混合，搅拌均匀，补水至1000ml。⑷调PH。一般用0.1molNaOH或1NHCl调PH至所需PH。一般PH调至5.8，但也有PH调到7.0的，不同材料的最适PH不一样。对培养基的凝固来说，PH较高时，培养基过硬，不便于培养材料吸收营养；PH过低，低到4.0以下时，培养基很难凝固。⑸分装：将培养基分装于100ml或50ml三角瓶中，每瓶50或30ml左右，封口包装。⑹灭菌：一般用1.1kg/cm2压力，在121℃下灭菌15~20min。灭菌时间应根据材料掌握。时间短，灭菌不彻底；时间长，会引起培养基成分降解。⑺放置备用。灭菌后