第三章动物细胞培养用液

第三章动物细胞培养用液动物细胞进行体外培养离不开其在体外生存、生长的各种溶液，此即培养用液。包括：培养液、缓冲液、平衡盐溶液、血清以及消化液、PH调整液和抗生素液等其它常用液。一、蒸馏水的制备/培养用水水是细胞体外生存最基本的环境条件。体外培养的细胞对水质特别敏感，对水的纯度要求较高，细胞培养用水的质量要求为电阻率在1×106Ώ•cm以上，双蒸馏水的水质刚刚达到这一标准。金属蒸馏器制备的蒸馏水，一般不作为培养用水。去离子水不建议使用。存放：棕色磨口试剂瓶。现多购买使用。二、缓冲溶液缓冲液：由缓冲剂配制成的溶液在加入一定量的酸或碱时其氢离子浓度改变甚微或几乎不变，此种溶液称为缓冲液。组成：弱酸与弱酸强碱盐弱碱与弱碱强酸盐例：H2CO3/NaHCO3Na2HPO3/NaH2PO3理想缓冲液应有以下几个特点：①能持续维持培养液的PH值恒定。②不干扰在培养液中进行的化学或生物化学反应。③不影响实验和观察。三、生理盐水最简单的生理盐水是，0.9%NaCl溶液，等渗。后期发展成为了现在的各种平衡溶液。四、平衡盐溶液（BSS）及其配制又叫盐溶液，集缓冲能力，生理盐水的等渗性以及培养液的营养供应特点于一体。主要成分：无机盐和G，另外含有少量酚红，酸碱度变化的指示剂。注意事项：①Ca2+、Mg2+物质要单独溶解。②所选用的试剂尽量用GR试剂或AR试剂。③配制消化液时先用无Ca2+、Mg2+的D-Hanks液或是PBS液。④加入酚红的量不得超过0.02g/1000ml。⑤配好后要分装，4℃保存，可配10×贮液，使用时过滤（滤器），不含G的可高压过滤。标准及纯度，一般化学试剂的品级：一级试剂、二级试剂、三级试剂、四级试剂国内标准名称：优级纯（保证试剂）、分析纯、化学纯、实验试剂国内简写代号：GRARCPLR国内标签颜色：绿色红色蓝色中黄色五、天然培养基包括各种动物血清、水解乳蛋白、胶原和组织提取液。1血清组织细胞培养中最常用的天然培养基是血清,因为血清中含有丰富的营养物质,包括大分子的蛋白质和核酸等,对促进细胞生长繁殖、粘附及中和某些毒性物质的毒性起着一定的作用。血清的好坏也常常是实验成败的关键。胎牛血清、新生牛血清、小牛血清、人AB血清、兔血清等，其中以胎牛血清最好，但较贵。①能提供细胞生存生长和增生所必需的生长调节因子。②能补充基础培养液中没有或量不足的营养成分。③含有一些可供贴壁依赖型细胞在培养皿表面贴附和铺展的生长基质成分。④提供载体蛋白，可结合维生素、脂质、金属离子等。⑤在有些情况下，血清有中和毒性物质保护细胞不受伤害的作用。⑥给培养液提供良好的缓冲系统。⑦提供蛋白酶抑制剂，保护细胞免受死细胞释放的蛋白酶的损害。血清的重要作用：血清的不足之处：①存在不少有害于细胞生长和繁殖。例：补体、免疫球蛋白和一些生长抑制因子等。②血清的成分不明确，影响对结果的分析。③不同动物，不同批次血清成分和活性差别比较大，使的培养结果不稳定。血清一般不自制，如果特殊需要需自制时要注意：①消毒②空腹③隔绝④倾斜、室温、4℃过夜⑤离心⑥滤过，血清检测2水解乳蛋白为乳白蛋白经蛋白酶和肽酶水解的产物，含有丰富的氨基酸，是常用的天然培养基，可用于许多细胞系和原代细胞培养。淡黄色粉沫，易结块，溶液呈酸性。配制：0.5g,Hanks,BSS,定容100ml,置室温下1-2h,高压灭菌,4℃,贮存。使用：0.5%水解乳蛋白,37℃水浴预温后,无菌下与合成培养液1:1混合使用,即可培养。3鼠尾胶原能促进组织和细胞的附着,改善细胞生长表面特性胶原来源有尾腱,真皮和牛眼的水晶体，实验室常用大鼠尾胶原。使用方法：①均匀涂于器皿的细胞生长面，不留液滴。②用氨水棉封口放于灭菌饭盒中③室温2h，氨气与鼠尾胶原作用，胶原凝固④BSS洗涤胶原面后，经细胞培养液浸泡过夜，37℃备用。六、合成培养基合成培养液是对细胞体内生存环境中各种已知物质在体外人工条件的模拟。但这种模拟不是被动和不加选择的。而是在体外反复实验和筛选、进行强化和重新组合后形成的人工合成培养基。合成培养基现有20多种，实际大多数cell培养选用的培养基仅七八种。如，TC199、DMEM、RPMI-1640、MEM等。1合成培养基的基本成分合成培养基的基本成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质。（1）氨基酸一般多为左旋（L-），有必须氨基酸，非必须氨基酸中的的谷氨酰胺，另外特殊需要加入其它氨基酸。是合成培养基的主要内容。（2）碳水化合物糖类为主，既是能量来源，也是合成某些氨基酸的原料。（3）无机离子培养基含有平衡盐液中的钾、钠等无机盐，有些培养基含有微量元素，如Fe2+、Zn2+、Ca2+等。（4）维生素各种维生素，包括脂溶性和水溶性维生素。（5）其它成分除了生长代谢所需的主要成分之外，为了优化生存环境，还添加一些其它成分。如，核酸降解物（嘌呤和嘧啶类）；抗氧化剂（抗坏血酸、谷胱甘肽等）；还有难培养的细胞，可应用非特异性细胞生长刺激剂2-巯基乙醇。2配制液体培养基，粉状培养基，参照说明书进行。注意事项：①严格按说明书进行。②不同厂家，批次，同一培养基比例可能不同。③三蒸水为三天内制备的（石英）④不宜过量配制，不得有沉淀。⑤谷氨酰胺，碳酸氢钠有的需自行加入。七、血清细胞培养基要想使cell生长和繁殖，必需在人工合成培养基中加入一定量天然培养基，血清，谷氨酰胺等。另外，还有防止污染的抗菌素。基础培养基加血清、谷氨酰胺、抗菌素等物质后叫细胞培养基或完全培养基，按血清含量又分为细胞生长培养基和细胞维持培养基。组成见P43页。八、无血清细胞培养基由于血清成分的复杂性和易污染性，常常给研究带来了麻烦，无血清培养基的发现和使用保证了实验结果的准确性，稳定性，并减少了污染和简化了程序。目前，常选用的无血清培养基多以合成培养基配成基础培养液，再补加其它成分。补加的成分主要有激素、生长因子、金属离子转移蛋白、脂肪酸、酶抑制剂和微量元素等。1基础培养液不少的合成培养液都可以做无血清培养液的基础培养基（见书）。最常用的是HamF12和DMEM混合液（1：1），再补加6-15mlHEPES与1.2g/LNaHCO3即可作为培养液。现已有商品化的DMEM/F12混合培养基粉剂出售，按说明书进行就可。2补充成分必需营养成分，酶抑制剂、生长基质等。有激素和生长因子，结合蛋白，贴壁因子等。激素：胰岛素、生长激素、胰高血糖素等、甾体激素等。生长因子：维持cell生存和增殖所必需的物质，依据化学性质可分为多肽生长因子和甾体生长因子。如，EGF、TGF、NGF、FGF2结合蛋白转铁蛋白TF（结合Fe及其它有毒金属离子），白蛋白与其它脂类，金属离子，激素等结合后，具有刺激细胞增殖作用。3贴壁因子贴壁因子：细胞体外培养时绝大多数真核细胞（贴壁依赖性细胞）需要固着于适当的基底，帮助细胞固着贴附的物质叫贴壁因子或胞外基质。配制：①配贮液（10×）1mg/ml,适当温度保存②选择适当贴壁因子保存③三蒸水或PBS稀释，0.1mg/ml工作液④滤菌⑤涂布⑥静置，洗涤4微量元素微量元素的增加较复杂，多采用商品包装，现多培养基中已加好无需再加。无血清培养基内必需增加酶抑制剂来中止残余酶的作用。如，大豆胰酶抑制剂，0.1-0.5%九消化液消化液中最常用的是胰蛋白酶液和EDTA液。1胰蛋白酶液主要作用：使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散。主要作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽腱。活力用解离酪蛋白的能力表示，常用有1:250，1：125两种。PH8.0，37℃时作用力最强。浓度有0.25%(m/v),0.125%,0.08%。配制选用不含Ca,Mg离子的BSS液，终止用血清或胰蛋白酶抑制剂。（配制P50页）2EDTA属于化学螯合剂。具有一定消化作用，毒性小，价格便宜。用D-Hanks液配成0.02%工作液，常和胰蛋白酶混合使用。原理：利用EDTA的螯合作用将组织间的Ca,Mg离子螯合掉破坏组织的完整性。3胶原蛋白酶液原理：使细胞间质的脯氨酸多肽水解，从而使细胞离散。常和胰蛋白酶联用，效果不错。十、PH调整液NaHCO3溶液，不同浓度，7.4%5.6%3.7%。10%醋酸液。Hepes，非离子缓冲液，缓冲能力强，维持时间长，多采用20mmol/l的浓度。十一、L-谷氨酰氨十二、抗菌素液•配制见书P53页。