PCR、RT-PCR常见问题及分析

升博生物专业服务PCR常见问题分析及解决方案重庆升博生物科技有限公司SHENGBOBIOTECHCO.,LTD.Sbio.tmmu.com.cn重庆升博生物科技有限公司PCR技术的发明1983KaryMullis发明1985开始有文章发表1993获诺贝尔奖广泛用于分子生物学研究领域Sbio.tmmu.com.cn重庆升博生物科技有限公司pcr动画.exePCR技术的基本原理模板DNA的变性：93℃-95℃左右，模板DNA与引物的退火(复性)：Ta=Tm-3~5℃引物的延伸：TaqDNA聚合酶之5’-3’DNA聚合酶活性变性--退火--延伸三个步骤Sbio.tmmu.com.cn重庆升博生物科技有限公司1234522557294时间（min）温度（℃）PCR的基本原理适温延伸3高温变性1低温退火2重复1~3步25~30轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍Sbio.tmmu.com.cn重庆升博生物科技有限公司PCR标准反应体系DNA模板引物反应缓冲液Mg2＋dNTP耐热聚合酶ddH2OSbio.tmmu.com.cn重庆升博生物科技有限公司反应体系对PCR扩增的影响DNA模板–纯度蛋白、多糖、酚类等抑制PCR反应–完整性模板降解会导致PCR扩增无产物–浓度浓度适当引物–设计长度适当、避免二级结构和二聚体–合成质量–浓度50uL体系引物加量为10-20pmolSbio.tmmu.com.cn重庆升博生物科技有限公司反应体系对PCR扩增的影响反应Buffer–pH、盐离子、稳定剂、增强剂–提供缓冲环境Mg2＋浓度–过高非特异性严重–过低无扩增产物dNTPMixture–浓度适当，避免反复冻融ddH2O–pH值适当，避免污染反应Buffer–pH、盐离子、稳定剂、增强剂–提供缓冲环境Mg2＋浓度–过高非特异性严重–过低无扩增产物dNTPMixture–浓度适当，避免反复冻融ddH2O–pH值适当，避免污染反应Buffer–pH、盐离子、稳定剂、增强剂–提供缓冲环境Mg2＋浓度–过高非特异性严重–过低无扩增产物dNTPMixture–浓度适当，避免反复冻融ddH2O–pH值适当，避免污染Sbio.tmmu.com.cn重庆升博生物科技有限公司如何选择最合适的DNA聚合酶PCR用耐热DNA聚合酶（PCR实验的不同需求）1Taq酶2pfu酶3HotstartTaq酶TaqplusLongTaqTaqplatinum4混合酶Sbio.tmmu.com.cn重庆升博生物科技有限公司1Taq酶——扩增效率最高发现–1969年，美国黄石国家公园温泉活性–5‘-3’DNA聚合酶活性强–5‘-3’DNA外切酶活性弱荧光探针（定量PCR方法）–3‘-5’DNA外切酶活性无错配率每个循环约1/6000–3‘末端加“A”能产物可直接进行“TA”克隆生产质检–诱导大肠杆菌表达、三次柱纯化，分离获得94kD重组蛋白。–无核酸酶和细菌DNA污染–能有效扩增人基因组单拷贝基因–室温放置一周，无明显活性改变。Sbio.tmmu.com.cn重庆升博生物科技有限公司2pfu酶——保真度高原理–具3’－5’核酸外切酶活性，即校正功能。–效率相对较低–3‘末端不加“A”，加A后才可进行TA克隆。用途–表达基因的克隆–基因的定点突变–细胞内基因点突变分析（SNP）Sbio.tmmu.com.cn重庆升博生物科技有限公司3HotStartTaq酶——特异性高热启动Taq酶原理–蜡封–抗体抑制–化学修饰提高PCR特异性，减少甚至避免非特异性扩增3‘加“A”，可直接做“TA”克隆用途–混杂模板–半定量、定量PCRSbio.tmmu.com.cn重庆升博生物科技有限公司4混合酶——高扩增效率＋高保真度Taqplus–Taq+pfu–用于复杂模板（GCrich,二级结构）扩增–大多数情况下可替代Taq,特别是产物在6Kb以上时，可扩10-20kb。LongTaq–Taq+pfu–超长片断扩增，15-40kb.Taqplatinum–HotStart+pfu–高扩增效率＋高保真度Sbio.tmmu.com.cn重庆升博生物科技有限公司根据PCR实验的不同需求基因组扩增、RT-PCR———————特异性基因突变、测序、表达克隆—————保真性构建基因图谱、测序等——长片段扩增复杂模板扩增(GC含量高、二级结构)—扩增效率Sbio.tmmu.com.cn重庆升博生物科技有限公司预配的PCR反应液DNA聚合酶反应缓冲液dNTPPCR增强剂PCRMasterMixSbio.tmmu.com.cn重庆升博生物科技有限公司特点•快速简便减少加样误差和污染•灵敏度高可扩增低至2个拷贝的目的模板•特异性强降低PCR反应的要求，增强特异性•稳定性好-20℃一年以上，反复冻融不影响活性。适用范围•大规模基因检测•目的基因拷贝数极低的样本•GC含量高,有二级结构的模板•复杂基因组样本PCRMasterMix产品特点升博生物专业服务PCR常见问题分析Sbio.tmmu.com.cn重庆升博生物科技有限公司PCR常见问题无扩增产物非特异性扩增或拖尾假阳性Sbio.tmmu.com.cn重庆升博生物科技有限公司问题1：无扩增产物现象：正对照有条带，而样品则无M样品A样品B正对照Sbio.tmmu.com.cn重庆升博生物科技有限公司1.纯度：含有抑制物2.浓度：含量低3.质量：全长4.结构：二级结构原因对策1.纯化模板或者使用优质试剂盒提取模板DNA2.加大模板的用量3.用好的反转录酶4.用温度高的反转录酶无扩增产物之模板原因Sbio.tmmu.com.cn重庆升博生物科技有限公司1.引物错误2.引物设计不好3.引物降解4.引物合成、纯化不好原因对策1.合成前检查2.评价、重新设计引物3.换一管新引物4.免费重新合成无扩增产物之引物原因Sbio.tmmu.com.cn重庆升博生物科技有限公司1.退火温度2.延伸时间3.循环次数原因对策1.递度PCR2.聚合酶的延伸速度3.适当增加循环数无扩增产物之PCR条件原因Sbio.tmmu.com.cn重庆升博生物科技有限公司现象：条带与预计的大小不一致或者非特异性扩增带问题2：非特异性扩增M12Sbio.tmmu.com.cn重庆升博生物科技有限公司1.引物特异性差2.模板或引物浓度过高3.酶量过多4.Mg2+浓度偏高5.退火温度偏低6.循环次数过多原因对策1.重新设计引物或者使用巢式PCR2.适当降低模板或引物浓度3.适当减少酶量4.降低镁离子浓度5.适当提高退火温度或使用二阶段温度法6.减少循环次数非特异性扩增Sbio.tmmu.com.cn重庆升博生物科技有限公司靶序列或扩增产物的交叉污染原因1.开管轻柔，防止形成气溶胶；防止靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外2.更换试剂、耗材3.试剂分装，贮存适当。4.更换实验室和所有试剂耗材。问题3：假阳性现象：空白对照出现目的扩增产物对策升博生物专业服务提高PCR特异性的策略Sbio.tmmu.com.cn重庆升博生物科技有限公司巢式PCR（Nest-PCR）递减PCR（TouchDownPCR）热启动PCR（HotStartPCR）使用PCR增强剂四种策略Sbio.tmmu.com.cn重庆升博生物科技有限公司策略之一巢式PCR（Nest-PCR）P1P2P3P4–增加有限量靶序列（如稀有mRNA）的灵敏度–降低了扩增多个靶位点的可能性–提高困难PCR（如5‘RACE）特异性Sbio.tmmu.com.cn重庆升博生物科技有限公司–前几个循环使用严谨的退火条件提高特异性。–循环设在比估算的Tm高大约5℃的退火温度下开始，然后每个循环降低1-2℃,直到退火温度低于Tm5℃。–特异性最高的目的模板会被优先扩增，这些产物在随后的循环中继续扩增占据优势。–递减PCR对于那些不了解引物和目的模板同源性程度的方法更为有用，如AFLP、DNA指纹分析等。策略之二递减PCR（TouchDownPCR）Sbio.tmmu.com.cn重庆升博生物科技有限公司–热启动主要是通过抑制一种基本成分延迟DNA合成，直到PCR仪达到变性温度通常选择热启动Taq酶热启动PCR是除了好的引物设计之外，提高PCR特异性最重要的方法之一策略之三热启动PCRSbio.tmmu.com.cn重庆升博生物科技有限公司甲酰胺，DMSO，甘油，甜菜碱等可能的机理：降低熔解温度，有助于引物退火，辅助DNA聚合酶延伸通过二级结构区增强剂浓度要适当策略之四使用PCR增强剂升博生物专业服务RT-PCR简介Sbio.tmmu.com.cn重庆升博生物科技有限公司主要内容RT-PCR原理RT-PCR步骤常见问题分析Sbio.tmmu.com.cn重庆升博生物科技有限公司两步法RT-PCRmRNA5’3’AAAAAAAAPoly(A)*尾TTTTOligo(dT)SuperRnaseH-ReverseTranscriptaseTTTTAAAAAAAAmRNAcDNATTTTcDNA3’5’5’3’PCR扩增……Sbio.tmmu.com.cn重庆升博生物科技有限公司SuperRnaseH-ReverseTranscriptase3’5’TTTTcDNATTTTcDNA……PCR扩增5’3’mRNAAAAAAAAAPoly(A)*尾3’5’3’5’一步法RT-PCRSbio.tmmu.com.cn重庆升博生物科技有限公司两步法与一步法RT-PCR比较两步法一步法引物OligodT，随机引物，GSPGSP优点PCR扩增失败时便于分析原因特异性和灵敏度高适用检测多种目的基因半定量RT-PCR大量样品分析定性Sbio.tmmu.com.cn重庆升博生物科技有限公司分析基因的转录水平获取目的基因合成cDNA探针RT-PCR主要用途Sbio.tmmu.com.cn重庆升博生物科技有限公司逆转录酶的选择AMV：–禽成髓细胞瘤病毒，逆转录酶和RNA酶H活性。最适42℃，最新版本可达60℃（Bioflux公司）。MMLV：–Moloney鼠白血病病毒，逆转录酶，RNA酶H活性较弱。最适37℃，最新版本42℃（赛百盛）SuperRNaseH-ReverseTranscriptase–MMLV反转录酶的RNaseH-突变体，它能将更大部分的RNA转换成cDNA，最适42℃。（Tiangen天根生化）Sbio.tmmu.com.cn重庆升博生物科技有限公司RNaseH的作用水解RNA-DNA杂合链中的RNA–SuperRNaseH-ReverseTranscriptaseMMLV反转录酶的RNaseH-突变体逆转录效率高Sbio.tmmu.com.cn重庆升博生物科技有限公司RT-PCR引物的选择随机引物：–适用于长的或具有发卡结构的RNA,特异性最低。起始浓度范围为20µl体系50-250µg。Oligo(dT15-18)：–适用于具有PolyA尾巴的RNA。起始浓度范围为20µl体系0.2-0.5µg。特异性引物：–与目的序列互补，是反义寡核苷酸，适用于目的序列已知的情况。起始浓度范围为20µl体系1pmol。Sbio.tmmu.com.cn重庆升博生物科技有限公司提高RT-PCR灵敏度分离高质量RNA使用无RNaseH活性的逆转录酶Sbio.tmmu.com.cn重庆升博生物科技有限公司提高RT-PCR特异性提高逆转录酶保温温度减少基因组DNA污染升博生物专业服务RT常见问题Sbio.tmmu.com.cn重庆升博生物科技有限公司1.RNA降解或起始量少2.RNA含抑制成分3.cDNA5’端不全4.目的基因在组织中不表达或表达量太低原因对策1.分离高质量的RNA2.使用高温逆转录酶，如RT007（BioFlux）3.使用随机引物或GSP4.尝试其它组织问题1：R