PCR技术及其应用

第八章PCR技术及其应用PCR技术的建立①Khorana(1971)等提出在体外经DNA变性,与适当引物杂交,再用DNA聚合酶延伸,克隆DNA的设想—“修复复制”但由于测序和引物合成的困难，以及70年代基因工程技术的发明使克隆基因成为可能，所以，Khorana的设想被人们遗忘了……②1983年,Mullis发明了PCR技术,使Khorana的设想得到实现Mullis的构思引物引物DNA聚合酶DNA聚合酶特定DNA片段94℃变性50-65℃退火XX℃延伸94℃55℃37℃TaqDNA聚合酶（thermusaquaticus)酶活性(%)温度(℃)40506070809010010080604020③1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技术72℃94℃55℃PCR循环KaryB.MullisTheUnusualOriginofthePolymeraseChainReaction1989年美国《Science》杂志列PCR为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。“我不大喜欢动手,我宁肯不动手,我不喜欢做费力的事。作为一个发明家,重要的一点是为解决某些问题而尽力设计一个简捷的动手方案。”这是PCR的发明者Mullis在1991年对《研究与发展》杂志(R&D)记者说的一番话第一节PCR技术原理和工作方式第八章PCR技术及其应用一、PCR的基本原理类似于DNA的体内复制首先待扩增DNA模板加热变性解链，随之将反应混合物冷却至某一温度，这一温度可使引物与它的靶序列发生退火，再将温度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸这种热变性-复性-延伸的过程就是一个PCR循环，PCR就是在合适条件下的这种循环的不断重复。PCRCycle-Step1-DenaturationTemplateDNAbyHeat(95oC)TargetSequenceTargetSequencePCR原理示意图①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；PCRCycle-Step2–Temperatureislowered(Tm)andprimersannealtotargetsequences②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；PCRCycle-Step3-At72oCTaqDNApolymerasecatalysesprimerextensionascomplementarynucleotidesareincorporated③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链。Endofthe1stPCRCycle–Resultsintwocopiesoftargetsequence每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点重复30轮后230=1,073,741,824模板DNA第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增第4轮扩增第5轮扩增第6轮扩增理想拷贝数=2nn循环次数实际拷贝数=(1+x)nX平均效率,约为0.85n循环次数TargetAmplificationNo.ofNo.AmpliconCyclesCopiesofTarget122438416532664201,048,576301,073,741,8241cycle=2Amplicon2cycle=4Amplicon3cycle=8Amplicon4cycle=16Amplicon5cycle=32Amplicon6cycle=64Amplicon7cycle=128Amplicon1234522557294时间（min）温度（℃）PCR反应适温延伸3高温变性1低温退火2重复1~3步25~30轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍二、PCR反应体系缓冲液dNTP引物模版DNA聚合酶1.缓冲液标准的缓冲液含10mMTris·HClpH为8.3-9.0（室温），而在延伸温度（72℃）下，pH值接近7.2缓冲液中含有一种二价阳离子，用于激活DNA聚合酶的活性中心，一般使用Mg2+，有时使用Mn2+缓冲液中还含有50mM的钾离子有些缓冲液中还加入一些添加剂和共溶剂可降低错配率，提高富含G+C模板的扩增效率。Mg2+Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降；Mg2+过高影响反应特异性。Mg2+可与负离子结合，所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。一般以MgCl2的形式提供，标准浓度为1.5mM。Mg2+浓度的高低会影响扩增的特异性和产率2.dNTP脱氧核苷三磷酸是DNA合成的底物标准的PCR反应体系中含有等摩尔浓度的4种dNTP，终浓度一般为200mM（即饱和浓度）浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产量dNTP可与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度下降，影响DNA聚合酶的活性。3.引物在多数试验中人们习惯使用的引物浓度为各1mM，即1pmol/ml浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降引物设计原则①引物长度一般以18～30bp为宜，过短则降低特异性，过长则会引起引物间的退火而影响有效扩增，同时也增加引物合成的成本。②避免引物内部出现二级结构，避免序列内有较长的回文结构，使引物自身不能形成发夹结构。③G/C和A/T碱基均匀分布，G+C含量在40～60%之间，引物碱基序列尽可能选择碱基随机分布，避免出现嘌呤或嘧啶连续排列。④要避免两个引物间特别是3`末端碱基序列互补以及同一引物自身3`末端碱基序列互补的，使它们不能形成引物二聚体或发卡结构。⑤引物3`末端碱基一般应与模板DNA严格配对，并且3`末端为G、C或T时引发效率较高。⑥引物5`末端碱基可不与模板DNA匹配，可添加与模板无关的序列(如限制性核酸内切酶的识别序列、ATG起始密码子或启动子序列等)，便于克隆和表达，但其保护碱基有一定的要求。⑦引物的碱基顺序不能与非扩增区有同源性。4.模板单、双链DNA均可。不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。用人类或哺乳动物基因组DNA进行扩增时，一般使用1μgDNA以酵母菌、细菌、质粒和M13噬菌体噬菌斑的DNA作模板时，分别需要10ng，1ng，1pg和1%噬菌斑。5.DNA聚合酶①TaqDNA聚合酶来自嗜热古细菌的嗜热水生菌（Thermusaquaticus），TaqDNA聚合酶分子量大小为94kDa，为单分子酶，在75℃活性最强。具有5’-3’合成活性和5’-3’外切活性,但是无3’-5’外切活性。由于没有3'-5'外切活性，在扩增过程中有8.9-11x10-5的错配几率。在95℃的半衰期为40分钟。启动PCR反应的能力很强，聚合速度快，在72℃的聚合速度为每秒30-100碱基。②TthDNA聚合酶TthDNA聚合酶来自嗜热热细菌（Thermusthermophilus）HB8，由Promega公司开发成商品。TthDNA聚合酶分子量为94kDa，在74℃进行扩增，在95℃的半衰期为20分钟。在Mg2+存在条件下以DNA为模板合成DNA，而在MnCl2存在下可以RNA为模板合成cDNA。因此可在高温下做RT-PCR、反转录和引物延伸（primerextension）反应，避免RNA反转录过程中形成的二级结构。③VentDNA聚合酶VentDNA聚合酶是从由火山口分离的嗜热球菌Thermococcuslitoralis中分离的第一个具有3’-5’外切活性的高温DNA聚合酶，由NewEnglandBlabs公司开发出商品。酶分子为85kDa，具有更长的半衰期，在100℃（使用MgSO4）时，其半衰期为1.8小时。④PwoDNA聚合酶PwoDNA聚合酶来自Pyrococcuswoesei（BM），大小为90kDa，由原德国宝灵曼公司开发。在100℃的半衰期大于2小时，出错率低。是使用较多的具有3'-5'外切活性的且具有高保真度的PCR酶。⑤PfuDNA聚合酶PfuDNA聚合酶来自激烈热球菌具有理想的扩增保真度，具有极高的热稳定性，是目前使用最广泛的具有3'-5'外切活性的PCR酶。⑥商用混合酶为了提高扩增的保真度或扩增较长的DNA片段，将TaqDNA聚合酶的强启动能力和具有3'-5'外切活性的高温DNA聚合酶的高持续活性和校正功能结合起来，可以达到很好的效果。三、PCR反应程序（1）变性使双链DNA解链为单链95℃20-30秒(2)退火温度由引物长度和GC含量决定。增加温度能减少引物与模板的非特异性结合;降低温度可增加反应的灵敏性。（3）延伸70-75℃延伸时间由扩增片段长度决定（4）循环次数主要取决于模版DNA的浓度一般为25-35次次数过多：扩增效率降低，错误掺入率增加PCR反应中的注意事项（一）防止污染试剂小量分装吸头及EP管一次性使用器皿及工作区域要分开，无菌操作（二）设立对照阳性对照：阳性模板阴性对照：阴性模板试剂对照：除模板外的所有组分第二节PCR产物的克隆第八章PCR技术及其应用一、在PCR产物两端添加限制性酶切位点为了使PCR产物能够方便的装载到克隆载体上，可在扩增的过程中在其两端添加限制性酶切位点设计引物：正常的特异性序列、在引物的5‘末端添加酶切位点、保护序列、在选择酶切位点的种类时，要保证所选的酶切位点在扩增的DNA片段内部不存在。如果对扩增的DNA片段的序列不清楚，可优先选用切割频率相对较少甚至酶切位点为8个碱基序列的酶切位点。二、A/T克隆法TaqDNA聚合酶具有末端转移酶的活性可在DNA片段的3‘末端添加一个核苷酸，通常为A。因此TaqDNA聚合酶扩增的产物可与T-载体进行粘端互补连接，达到高效克隆的目的T-载体最初由Promega公司开发出商品，并一直沿用到现在，如和pGEM-TEasy在DNA的3’末端添加一个T碱基的方法:如用末端转移酶和底物ddTMP可以产生单个T的突出末端有些识别不对称序列的限制性内切酶，如MboⅡ、XcmⅠ和HphⅠ，在切割DNA后可直接产生一个3’突出的T用TaqDNA聚合酶和高浓度的dTTP也可产生3'突出的T三、平末端DNA片段的克隆1pPCR-ScriptAmpSK（+）克隆载体该载体从pBluescriptⅡSK（+）噬菌粒改造而来，将多克隆位点中的XbaⅠ和SpeⅠ位点改成SrfⅠ位点（5′-GCCC/GGGC-3′）。克隆DNA片段时，先将载体用SrfⅠ切成线状，再与目标DNA片段混合作连接反应。在连接体系中除了添加T4DNA连接酶外，还加入SrfⅠ酶。在这个反应体系中，当载体发生自连后，SrfⅠ酶又会将其切开，载体就处于酶切与连接的动态平衡中只有当载体与目标DNA片段连接后，酶学反应才能稳定下来，从而将总体的反应平衡向载体与目标DNA片段连接这个方向倾斜。2pCR-Blunt克隆载体pCR-Blunt载体最大特点是在lacZ’基因的下游融合了一个ccdB基因，该基因对大肠杆菌是致死的。该载体大小为3.5kb，含卡那霉素抗性基因和Zerocin抗性基因在克隆外源平末端DNA片段时，先将改载体切成线状，再与目标DNA连接，转化大肠杆菌如果载体发生自连，获得这些载体的大肠杆菌宿主细胞就会死亡，只有当外源DNA片段与载体连接后，ccdB基因的表达受到阻断，重组质粒才能在大肠杆菌中存在下来。四、长片段DNA的PCR扩增在长片段的PCR扩增过程中高温会降低缓冲液的缓冲能力，从而损害模板DNA和PCR产物在高温下其它二价离子的存在会促进DNA的裂解长片段DNA分子的变性比短片段困难DNA聚合酶与模