RNA-directRealtimePCRMaster

08-01One-stepqPCRKitRNA-directTMRealtimePCRMasterMixCodeNo.QRT-101,101T研究用使用说明书TOYOBOCO.,LTD.BiochemicalOperationsDepartmentOSAKAJANPANDistributor:ShanghaiSOLOMONbio-sci&tech,Co.Ltd.Tel:[phone]Email:[e-mail]－目录－[1]简介········································································································1[2]制品内容·····························································································3[3]必需品···································································································4[4]使用方法······························································································6[5]相关实验····························································································12[6]常见问题····························································································15[7]相关产品····························································································17【注意】本产品为研究用试剂。请勿作为诊断、临床试剂使用。在使用本产品时，请严格遵守实验室的一般注意事项，安全操作。“PurchaseofthisproductisaccompaniedbyalimitedlicensetouseitinthePolymeraseChainReaction(PCR)processforTheResearchFieldinconjunctionwithathermalcyclerwhoseuseintheautomatedperformanceofthePCRprocessiscoveredbytheup-frontlicensefee,eitherbypaymenttoAppliedBiosystemsoraspurchased,i.e.,anauthorizedthermalcycler.”※LightCyclerTM是IdahoTechnologyInc.的注册商标。※TaqMan®是RocheMolecularSystemsInc.的注册商标。※ABIPRISM®是AppliedBiosystemsInc.的注册商标。RNA-directRealtimePCRMasterMix垂询电话：[phone]Http://www.bio-toyobo.cn1[1]简介本品采用ThermusthermophilusHB8株来源的rTthDNA聚合酶，该酶在二价锰离子（Mn2+）存在下具有很强的逆转录活性，利用该特性，开发出单酶一步法定量PCR试剂盒。逆转录反应和PCR反应在同一反应体系连续进行，仅需一次加样即可完成，减少了样品间交叉污染的危险，而且操作简便，尤其适用于高通量实验。◆特征◆1.逆转录反应和定量PCR反应在同一反应体系中进行本品以RNA为模板，逆转录反应和PCR反应在同一反应体系连续进行，实验快速方便，非常适合于高通量实验。同时也减少了样品间交叉污染的风险。2.可应用于高级结构复杂的RNA和高GC含量的模板本品采用单种耐热性rTthDNA多聚酶。和通常的逆转录酶相比较，可以在高温进行逆转录，非常有利于对具有复杂高级结构的RNA模板进行逆转录反应，同时该酶对高GC含量的模板也有出色的扩增表现，在定量PCR实验中也能高效扩增。3.快速热启动本品采用抗体热启动，对控制非特异性扩增非常有效。同时，抗体在高温下会迅速失活，释放多聚酶活性，最大限度地避免了高温对RNA模板和聚合酶活性的损伤。4.高适用性可应用于LineGene（BIoFlux公司），LightCycler（Roche公司），ABIPRISM（ABI公司）等仪器。RNA-directRealtimePCRMasterMix垂询电话：[phone]Http://www.bio-toyobo.cn2[2]制品内容本品含以下组分。品名内容保存QRT-101(50μl反应x100回用)QRT-101T(50μl反应x40回用)RNA-directTMRealtimePCRMasterMix-20℃（4℃，2个月）避光保存500μlx5500μlx250mMMn(OAc)2-20℃500μlx1200μlx1RNA-directTMRealtimePCRMasterMixMasterMix是2×反应液，含反应buffer、dNTPs、rTthDNA多聚酶和多聚酶抗体，以及passivereference。使用时，加入RNA模板、引物、Mn(OAc)2溶液及DEPC水至1×即可。MasterMix请在-20℃保存，融解后须上下颠倒混刀方可使用。使用后重新-20℃保存，通常冻融10次以内不会影响实验，但也请尽量避免反复冻融。如果一次使用量较少，可以在融解后分装成几管，每次取一管使用。如果短期内需多次使用，可在4℃保存，但须在2个月内用完。注意必须避光保存。50mMMn(OAc)2逆转录反应必需溶液。通常按反应体系的1/20体积（终浓度2.5mM）添加，根据RNA模板的不同，也可适当增减Mn(OAc)2的终浓度，以获得更高的扩增效率。RNA-directRealtimePCRMasterMix垂询电话：[phone]Http://www.bio-toyobo.cn3[3]实验必需品除本品外，还需以下仪器和试剂。·定量PCR仪器本品适用于LineGene（BIoFlux公司），LightCycler（Roche公司），ABIPRISM（ABI公司）等仪器。请根据各仪器的操作说明书进行实验。·引物及探针请根据目的基因的序列设计引物以及探针，引物以及探针设计对定量PCR实验的精确性和重现性非常重要。以下是设计引物的一般注意事项：-引物长度20-30mer，GC含量在40-60％之间。-扩增片段应小于200bp，过长的片段会降低扩增效率，而且容易导致非特异性反应，影响准确定量。-引物设计尽量横跨内含子，探针应选择在外显子的边缘，以防止基因组DNA的扩增而引起假阳性。·RNase-free水建议使用超滤制备的RNase-free水，如果使用DEPC水，请通过高压灭菌去除DEPC，否则残留的DEPC会影响反应。另外，用于定量PCR的水不要和其它实验混用，以避免污染影响定量。·TotalRNA本品可直接以TotalRNA作为模板进行定量。通过常规AGPC（AcidGuanidium-Phenol–Chloroform）法制备的TotalRNA中可能会混入基因组DNA，从而造成假阳性，必要时可用DNaseI等试剂去除。在组织、细胞等样本中，作为目标检测对象的mRNA含量通常仅占TotalRNA的1-2％。·poly(A)+RNA(mRNA)具有poly(A)+结构的mRNA可通过oligo(dT)制备。通过纯化过程，mRNA得到高度浓缩，通常用于对mRNA的高灵敏度检测。需要注意的是，mRNA比TotalRNA更容易被RNase所降解，操作时需要特别小心。RNA-directRealtimePCRMasterMix垂询电话：[phone]Http://www.bio-toyobo.cn4[4]使用方法1.使用LineGene(BioFlux公司)的TaqMan®分析法(1)反应液的配制[PCR反应液(例)]蒸馏水（RNase–freeGrade）Upto10μlRNA-directTMRealtimePCRMasterMix5μl50mMMn(OAc)20.5μl引物1(终浓度0.3μM)3pmol引物2(终浓度0.3μM)3pmolTaqMan探针(终浓度0.2μM)2pmol样品RNA溶液500ngTotal10μl·蒸馏水必需用RNase-free水，建议用过滤法生成的RNase-free水。如用DEPC水，请通过高压灭菌彻底去除DEPC。另外，避免与其它实验混用RNase-free水。·引物添加量在2-6pmol（0.2-0.6μM）间调整，扩增不好时，可适当加大引物量，但引物量过多，可能会造成非特异性扩增。·探针添加量在0.5-3pmol（0.05-0.3μM）间调整，扩增不好时，可适当加大TaqMan探针量，但TaqMan探针量过多，可能会造成非特异性扩增。·Mn(OAc)2终浓度通常为2.5mM，根据RNA模板浓度和序列的不同，有时在1.5-3.5mM浓度范围内适当增减Mn(OAc)2浓度会得到更好的结果。·作为的模板的RNA，通常TotalRNA不要超过500ng，poly(A)+RNA（mRNA）不要超过100ng，模板过多会降低反应效率，从而造成扩增曲线的线性不好。(2)PCR的实施[RT-PCR温度设定(例)变性190℃30s↓RT61℃20min↓变性295℃30s↓RNA-directRealtimePCRMasterMix垂询电话：[phone]Http://www.bio-toyobo.cn5PCR循环95℃15s（45Cycles）60℃45s（datacollection）↓熔解曲线分析·本品是高速热启动产品（参见第2页），第一次变性过程90℃，30s（变性1）后，即可充分释放酶活，过分加热会影响酶活性及损伤模板RNA的稳定性。·请根据所使用的荧光色素类型，选择相应的detectionchannel。2.AppliedBiosystems7900HT（ABI公司）的TaqMan®分析法(1)反应液的配制[PCR反应液(例)]蒸馏水（RNase–freeGrade）Upto50μlRNA-directRealtimePCRMasterMix25μl50mMMn(OAc)22.5μl引物1(终浓度0.3μM)15pmol引物2(终浓度0.3μM)15pmolTaqMan探针(终浓度0.2μM)10pmol样品RNA溶液2.5μgTotal50μl·蒸馏水必需用RNase-free水，建议用过滤法生成的RNase-free水。如用DEPC水，请通过高压灭菌彻底去除DEPC。另外，避免与其它实验混用RNase-free水。·因为添加量在10-30pmol（0.2-0.6μM）间调整，扩增不好时，可适当加大引物量，但引物量过多，可能会造成非特异性扩增。·因为添加量在2.5-15pmol（0.05-0.3μM）间调整，扩增不好时，可适当加大TaqMan探针量，但TaqMan探针量过多，可能会造成非特异性扩增。·Mn(OAc)2终浓度通常为2.5mM，根据RNA模板浓度和序列的不同，有时在1.5-3.5mM浓度范围内适当增减Mn(OAc)2浓度会得到更好的结果。·作为的模板的RNA，通常TotalRNA不要超过2.5μg，poly(A)+RNA（mRNA）不要超过500ng，模板过多会降低反应效率，从而造成