武汉大学遗传学第6章真核生物重组的分子机制

6.3真核生物重组的分子机制6.3.1同源重组发生在减数分裂前期重组(recombination)是已经存在的遗传物质产生新的组合的过程。分子间或染色体间重组;无论是分子内还是染色体内重组都是酶依赖的过程，新的遗传物质通过DNA的剪切和连接产生。同源重组（homologousrecombination）又称普遍性重组（generalizedrecombination），它的发生是依赖于较大范围的DNA同源序列的联会。HomologousrecombinationinvolvesareciprocalexchangeofsequencesofDNA,e.g.betweentwochromosomesthatcarrythesamegeneticloci.重组对之间需要有同源性。调节这一过程的蛋白(如大肠杆菌中的RecA)不是序列专一性的，而是同源依赖的。经常涉及长的同源区域(如减数分裂中)。真核生物的遗传重组发生在减数分裂时期的同源染色体的非姊妹染色单体之间，而且染色体或DNA分子之间相互交换对等的部分。重组热点:即某类序列发生重组的概率高于其他序列。真核生物的染色质状态影响重组，如异染色质及其附近区域很少发生重组。同源重组对同源区的长度要求：大肠杆菌活体重组至少要求20～40bp同源序列哺乳动物基因间的重组要求同源序列在150bp以上。同源区越长越有利于同源重组。在真核生物中，双链DNA分子间基因重组是完成减数分裂所必需的，而且基因重组发生在减数分裂前期（图6－12）（1）Holliday模型（霍利迪模型）狭义的遗传重组专指因为DNA分子内断裂—接合而引起基因交流的过程。同源重组有时又叫交换（crossingover）它发生在DNA同源序列之间。1964年，R.Holliday设想了一个模式，用来解释同源重组，经过许多细节上的修改：Hollidaymodelforreciprocalgeneticrecombination图五6.3.2同源重组的分子模型1、同源染色体的识别和配对排列2、两条多核苷酸链在对应位置断裂并相互侵入（交换）3、酶的作用使交换的链连接形成Holliday中间体4、分枝移位（Branchmigration）形成异源双链DNA（HeteroduplexDNA）5、异源双链DNA转动，再次拉长Holliday中间体6、由内切酶在水平方向或垂直方向切开Holliday中间体7、产生带间隙的双螺旋8、酶的作用使隙连接起来图五(2)、Meselson-Radding模型（单链侵入模型）单链侵入模型。在两个DNA分子中的一个单链发生断裂，游离出一个单链末端侵人到另一个DNA分子中。被切割的DNA留下的缺口由DNA聚合酶进行修复(虚线)。在另一个DNA分子中被替代的链降解，而两个末端被连接(见箭头)。开始，一个异源双链(用斜线代表)将只在两个DNA分子中的一个形成，支链迁移将在另一个DNA分子上产生另一个异源双链。像在Holliday模型一样，异构化使两侧的DNA分子重组。通过这个模型，异源双链首先只在两个DNA分子中的一个形成。然后一旦Holliday连接体形成，支链迁移能在另一个DNA分子上产生异源双链。这就解释了两个DNA分子中异源双链是如何形成的.双链断裂重组模型（Double-strandbreaksinitiaterecombination）虽然Holliday模型以及随后的Meselson和Radding所作的修改可以解释生物中发生的大多数同源重组事件，但仍有一些例外的重组现象，最典型的例子为基因转换(geneconversion)。基因转换首先在酵母及真菌中被发现，现已证实在许多生物中存在。酵母中配子融合产生杂合子，后者经减数分裂形成有4个孢子的子囊。假如配子在某一座位有不同的等位基因，正常情况下2个孢子将表现同一基因型，另2个孢子表现另一基因型。但有时会出现例外，即这种2：2的分离比例由3：1比例取代。这种现象被称为基因转换，即一种等位基因形式转变为另一种等位基因形式，只发生在减数分裂时期。有一种双链断裂模型用于解释重组过程中发生的基因转换事件，它们并非由单链缺口起始，而是先在1个双链分子中产生断裂，即2个单链在同一位置产生缺口,然后将这2个缺口转移到同源的另一双链分子。（图：哺乳动物DNA双链断裂重组机制）6.3.3联会复合体与重组在减数分裂过程中，同源染色体配对形成联会复合体。多年来，认为联会复合体与重组有关，有可能是DNA重组的必要前提。而近年研究表明，联会复合体是重组的结果，而不是原因。（1）联会复合体在双链断裂后形成对酵母的研究结果证明，不论是同源重组还是位点专一性重组，只有双链断裂才能起始重组。双链断裂也发生在减数分裂早期，而且是在联会复合体形成之前在一种酵母突变（rad50）中，由于突变阻止平齐末端转变为单链突出端，导致重组无法进行，可见双链断裂对于重组是必需的前提。重组与联会复合体的形成关系密切，果蝇和酵母中研究结果表明，凡是不能进行染色体配对的突变体都不能发生重组。由此可见产生双链断裂并进一步引发重组的系统是很保守的。根据rad50突变型不能将中央成分转变为联会复合体的现象，认为在减数分裂中，联会复合体是染色体配对所必需的，进而使分子水平引起重组这一传统观点受到了挑战。在酵母的研究中发现，联会复合体是在双链断裂起始重组之后形成，它一直持续到重组体形成，故联会复合体对于重组的形成不是必需的。而在一些缺失正常联会复合体的突变体中重组型仍可以形成，不能进行重组的突变型则不形成联会复合体。这充分表明：联会复合体仅仅是随染色体配对之后的重组结果。人们一直认为：Holliday结构的解离方式决定了最终是产生非交换产物还是交换产物，即取决于解离发生在哪些链上。但是最近对于非交换和交换产物生成时间的分析表明，交换产物直到接合分子第一次产生后的相当一段时间才会出现，而非交换产物几乎与接合分子同时出现。如果两种产物由同一解离过程产生，那么它们就应在同一时间出现。这一时间上的差异表明，交换产物不是按原先设想的通过接合分子解离产生的，而是由另一条途径产生。（2）同源染色体配对与联会复合体的形成是两个独立的过程突变可以发生在染色体配对或是联会复合体形成的任一过程，并且彼此互不干涉。Zip2突变型中染色体可以配对，但不能形成联会复合体，所以同源染色体之间的识别不依赖于重组或是联会复合体的形成。在rad50突变体中，双链断裂后的5′端与SpoⅡ蛋白相连［图6－15（b）］。只有SpoⅡ被移走后，核酸酶才能发挥作用，并证明至少有9种其他蛋白质共同参与双链断裂过程，一组蛋白质将双链断裂端转变为3′羟基突出的单链末端；另一组蛋白质使单链末端侵入同源双链DNA分子。图6－15（b）迄今还不能完全揭示重组的发生与所观察到的不同结构——重组结与交叉的联系，且在分子水平上阐明其本质。6.4基因转变及其分子机制6.4.1异常分离与基因转变在四分子分析中已知一对等位基因杂交子代的子囊可形成6种正常分离类型：AAAAaaaa或aaaaAAAAAAaaAAaa或aaAAaaAAAAaaaaaAA或aaAAAAaa这只是四分子中是否发生重组和纺锤体随机取向而形成，两种孢子的比例相等，即等位基因A:a＝4:4。后来发现有些孢子分离比例异常，如3:5和6:2以及异常的4:4分离在脉孢菌和粪生粪壳菌（Sodariafimicala）等子囊菌中也发现了一些异常分离（abnormalsegregation）现象。Mitchell将与维生素B6合成有关的不同的突变型进行杂交，将两个吡哆醇突变株杂交:＋pdxp×pdx＋取得子一代子囊后，对585个子囊中的孢子依次解剖，进行培养和鉴定。他发现其中4个子囊中有野生型的孢子对出现，可是跟预期的相反，如果这两个基因间发生了重组，重组后应该同时出现的双突变型（pdxpdxp）孢子对却没有发现（表6-7）怎样解释这一现象？不可能是突变，因为它们的频率远比这些基因的正常突变率高得多。分析的方法是灵敏的，如果有双突变的话，就能够检出。Mitchell的上述实验结果用图6-16来表示。由于重组，出现了完全野生型的孢子对（＋，＋），但没有重组的对应产物——双突变型的孢子对（pdxpdxp），结果应如图6-16所示。然而发生的情况说明尽管pdxp出现异常的3:1分离，但紧密连锁的pdx基因却显示出正常2:2分离。这些反常的情况，好像是一个基因转变为它的等位基因，这种现象称为基因转变（geneconversion）。图6-16中，基因pdxp转变为pdxp＋（或＋），图中以磑表示该基因发生了基因转变。所以双突变型的孢子对没有出现。6.4.2基因转变的类型基因转变的类型分为：①染色单体转变（chromatidconversion），即减数分裂的4个产物中有一个产物发生了基因转变，出现6g＋:2g－或2g＋:6g－类型的子囊。图6-17（a）②半染色单体转变（half-chromatidconversion），即减数分裂的4个产物中，有1个产物的一半或两个产物的各一半出现基因转变，因而形成5:3或3:5和异常4:4即3:1:3:1类型的子囊，基因转变只影响半个染色单体分离显然是发生在减数分裂后的有丝分裂中，所以又称为减数后分离（postmeioticsegregation）。图6-17（b），（c）6.4.3基因转变的分子机制由Holliday模型和DSB起始重组模型都已清楚表明在对称的异源双链区存在着不配对碱基（如G-A，C-T），形成两个杂种分子。异源DNA不稳定，细胞内的修复系统能够识别不配对碱基，并以切除修复的方式完成修复过程,杂种分子得到校正。研究表明基因转变产生的机制是由于DNA的错配修复（Mis-mathchrepair）。具体过程为：图6－z11、在减数分裂前期亲本染色体配对2、链的交换产生两个错配部分3、经DNA合成过程切除和修复某条单链的某部分4、产生6：2（3：1）基因转变的m+基因转变是由于重组和修复所产生结构进行修复,4个产物恢复正常配对状态,子校正到＋（或g）时，修复后出现6一个杂种分子校正为＋，或校正为g时的半染色单体转变，分离比为3:5两个杂种分子均未校正，复制后出现异常的4＋:4g（或3:1:1:3）的分离按原来两个亲本的遗传两个杂种分子都被囊孢子分离正常＋:2g（或2＋:6g）的异常分离由于某些不配对碱基切除修复校正的结果与该区发生双交换的效应一致，其实是基因转变的结果，因此出现C值（并发系数）大于1，这称为负干涉（negativeinterference），即一个区域的交换引起邻近区域另一次交换频率的增加的现象。大量实验结果表明，大约有一半的子囊发生基因转变的同时伴随两侧遗传标记的重组，而“负干涉”形成的原因显然是基因转变的同时并不伴随两侧遗传标记的重组。基因转变不仅是专一的，而且是有方向的，它不仅涉及单个位点（或基因座），而且涉及染色体的一个区段，如一对含有两个基因差异的突变型杂交时，在某些子囊中可以发生几个基因同时发生转变的现象，称为共转变（coconversion）。共转变的频率大于独立转变的预期频率，两个基因距离越近，共转变频率越大，即在异源双链的同一区域内沿相同方向同时被修复校正的概率越大。基因转变的极化子模型（polaronmodel）：该模型假定内切酶首先作用于基因的一端，从起点开始，基因转变频率由高到低形成一个梯度，在染色体上呈现基因转变极化现象的这样一个区域称为一个极化子（polaron），有时一个极化子就相当于一个基因。6.5体细胞交换与基因定位6.5.1单倍体化与体细胞交换一种绿色霉菌——构巢曲霉（Aspergillusnidulan），其分生孢子是单核的。将两个不同营养缺陷型菌株所产生的分生孢子大量混合接种在基本培养基的表面，可以得到少量的原养型菌落。由于这些原养型菌落细胞含有来自两亲本的细胞核，因此称为异核体（heterokaryon）。异核体：在同一个细胞质中含有两种或多种不同基因型的细胞核的细胞、孢子或菌丝体。大量异核体中的核仍保持单倍体状态