第四章园艺植物病毒的脱除、检测及鉴定技术

第四章植物无病毒苗的培育本章内容：第一节无病毒苗培育的意义第二节培育无病毒苗木的方法第三节无病毒苗木的鉴定第四节无病毒植物的利用植物无病毒苗的培育第一节无病毒苗培育的意义一、无病毒苗木的概念是指不含该植物主要的危害病毒，即经检测主要病毒在植物体内的存在表现为阴性反应的苗木。通常危害植物的病毒有几百种，并且随着栽培时间的延长，危害程度越来越严重，种类越来越多。尤其是靠无性繁殖的作物，由于病毒通过营养体进行传递，在母株内逐代积累，危害日趋严重。而以种子进行繁殖的种类，可随着世代的交替而去除病毒，病毒只能危害一个世代。植物无病毒苗的培育二、病毒在植物上的危害病毒的危害给植物生产带来的损失很大，如草莓病毒的危害，使草莓产量严重降低，品质大大退化。葡萄扇叶病毒使葡萄减产10％~18％，花卉病毒的危害一般会影响花卉的观赏价值，其表现是花少而小，产生畸形、变色等。由于病毒对植物造成如此严童的危害，所以世界各国都积极开始重视这方面的研究。植物无病毒苗的培育三、无病毒苗培育的意义1.去除病毒危害，提高作物品质与产量。采用生物、物理、化学等途径防治病毒病收效甚微，甚至毫无成效。而通过组织培养的方法可以脱除严重患病毒植物的病毒种类，提高产量、质量。因此，到60至70年代在花卉、蔬菜和果树等得到广泛的应用。2.减少环境污染，有利于保护环境栽培去病毒植物可减少药剂的使用。植物无病毒苗的培育第二节无病毒苗培育的方法一、热处理脱毒二、微茎尖培养脱毒三、其他途径脱毒植物无病毒苗的培育—方法一、热处理脱毒（一）发现：1889年印度尼西亚爪畦人发现，患枯萎病的甘蔗(现证明为病毒病)，放在50-52℃的热水中保持30min，甘蔗就可去病生长良好。以后此方法被广泛用于防治许多植物的病毒病。热处理又称温治疗法。植物无病毒苗的培育—方法（二）原理是当植物组织处于高于正常温度的环境中时，组织内部的病毒受热后部分或全部钝化，不能生成或生成病毒很少，以致病毒含量不断降低从而达到脱毒的目的。植物无病毒苗的培育—方法（三）热处理方法1.温汤浸渍处理适用：休眠器官、剪下的接穗或种植的材料方法：50℃左右的温水中浸渍10min至数小时特点：方法简便易行，但易使材料受伤。植物无病毒苗的培育—方法2.热空气处理适用：对活跃生长的茎尖效果较好方法：将生长的盆栽植株移人温热治疗室(箱)内，一般在35~40℃下处理几十分钟至数月。处理时间因植物而异，如香石竹于38℃下处理两个月，其茎尖所含病毒即可被清除。马铃薯在35℃下处理几个月才能获得无病毒苗。特点：热处理方法主要缺陷是并非能脱除所有病毒。例如在马铃薯中，应用这项技术只能消除卷叶病毒。因此热处理需与其他方法配合应用，才可获得良好的脱毒效果。植物无病毒苗的培育—方法二、微茎尖培养脱毒（一）茎尖培养脱毒原理感染病毒植株的体内病毒的分布不均匀，病毒的数量随植株部位及年龄而异，越靠近茎顶端区域的病毒的感染程度越低，生长点(分生组织约0.1~1.0mm区域)则几乎不含或含病毒很少。茎尖培养脱毒，由于其脱毒效果好，后代稳定，所以是目前培育无病毒苗最广泛和最重要的一个途径。植物无病毒苗的培育—方法植物组织内病毒含量随与茎尖距离加大而增加的原因①在植物体内，病毒易于通过微管系统移动，但分生组织中无此系统；病毒在细胞间移动的另一个途径是通过胞间连丝，但它的速度极慢，难以赶上活跃生长的茎尖。②活跃生长的茎尖分生组织代谢活性很高，致使病毒无法复制。③若植物体内存在病毒钝化系统，它在分生组织中比在任何其它区域都有更高的活性而钝化病毒，使分生组织不受浸染。④茎尖分生组织存在较高水平的内源生长素，可抑制病毒的增殖。植物无病毒苗的培育—方法（二）培养基培养基：一般以White、Morel和MS作为基本培养基，尤其是提高钾盐和铵盐的含量会有利于茎尖的生长。植物激素：其种类与浓度对茎尖生长和发育具有重要的作用。适当提高生长素(0.1~0.5mg/L)与细胞分裂素的浓度，避免使用易促进愈伤组织化的2，4-D，宜换用稳定性较好的NAA或IBA，细胞分裂素可用Kt或BA。有时需添加活性炭。植物无病毒苗的培育—方法（三）微茎尖培养方法外植体茎尖（shoottip）茎的顶端分生组织（apicalmeristem）顶端分生组织及其下方1—3个幼叶原基构成茎的最幼龄叶原基上方的一部分，最大直径约100um,最大长度约250um植物无病毒苗的培育—方法1.外植体的预处理将带幼叶的茎芽叶片在75％酒精中浸蘸数秒钟（叶片包被严紧的芽，如菊花、兰花）或用0．1％次氯酸钠表面消毒l0min（叶片包被松散的芽，如香石竹，蒜和马铃薯等）。植物无病毒苗的培育—方法2.茎尖的剥离与接种在解剖镜下，将灭菌的外植体放在一个衬有无菌湿滤纸的培养皿内（防止茎尖变干），用解剖针将叶片和叶原基剥掉，当一个闪亮半圆球的顶端分生组织充分暴露出来之后，用解剖刀片将分生组织切下来，可带1~2枚幼叶，然后将其接种到培养基上。注意：剥离与接种尽量要快，以防茎尖变褐死亡。植物无病毒苗的培育—方法3.培养条件温度：22℃左右光强：2000~3000Lx光照时间：每天16h。微茎尖需数月培养才能成功。茎尖培养的继代培养和生根培养和一般器官的培养相同。由于在低温和短日照下，茎尖有可能进入休眠；所以较高的温度和充足的日照时间必须保证。植物无病毒苗的培育—方法（四）影响微茎尖培养的因素1．外植体大小外植体越大，茎尖越易成活，分化率越高，产生再生植株的机会越大，但脱毒效果越差；外植体越小，茎尖越难成活，分化率越低，产生再生植株的机会越小，但脱毒效果越好。叶原基的存在与否也影响分生组织形成植株的能力，一般认为，叶原基能向分生组织提供生长和分化所必需的生长素和细胞分裂素。植物无病毒苗的培育—方法2．培养条件在茎尖培养中，较高的温度和充足的光照有利于茎尖的培养。光下培养的效果通常比暗培养效果好，如马铃薯茎尖培养时，当茎已长到1cm高时光照强度便增加到4000Lx。植物无病毒苗的培育—方法3．外植体的生理状态最好取顶芽：旺盛生长的枝条顶芽比侧芽培养效果好（如香石竹和菊花）。宜选取萌动期的芽：取芽时间很重要，否则要采用某种适当的处理、打破休眠才能进行。植物无病毒苗的培育—方法三、其他途径脱毒（一）愈伤组织培养脱毒通过植物的器官和组织的培养去分化诱导产生愈伤组织，然后从愈伤组织再分化产生芽，长成小植株，可以得到无病毒苗理由：①病毒的复制速度赶不上细胞的增殖速度；②有些细胞通过突变获得了抗病毒的抗性。缺点：植株遗传性不稳定，可能会产生变异植株植物无病毒苗的培育—方法（二）茎尖微体嫁接1.概念：将无病毒茎尖（0.4~1.0mm）嫁接在培养基上培养的实生砧木上，以获得脱毒苗木的技术。2.适宜：茎尖培养难以生根的植物，如桃、柑橘、苹果等3.无病毒茎尖来源：成年无病毒植物、温室培养的植物、热处理植物和脱毒试管苗。植物无病毒苗的培育—方法（三）化学疗法脱毒许多化学药品(包括嘌呤、嘧啶类似物、氨基酸、抗菌素等)对离体组织和原生质体的培养具有脱毒效果。常用的药品有：8-氮鸟嘌呤、2-硫脲嘧啶、杀稻瘟抗菌素、放线菌素D、庆大霉素等。例如，将100ug2-硫脲嘧啶加入培养基可除去烟草愈伤组织中的PVY(马铃薯病毒)。植物无病毒苗的培育第三节无病毒植物的鉴定从上述途径培育得到的植株，必须经严格鉴定，证明确实无病毒存在，才是其正的无病毒苗，才可提供给生产应用。鉴定的方法有多种：一、指示植物(indicatingPlant)法二、抗血清(antiserum)鉴定法三、电子显微镜(electricmicroscope)检查法植物无病毒苗的培育一、指示植物法1.概念：利用病毒在其他植物（指示植物或鉴别寄主）上产生特定症状（枯斑和空斑）作为鉴别病毒存在与否和种类的方法。2.局限性：它只能鉴定靠汁液传染的病毒。3.适用：草本与木本植物4.优点：灵敏、准确、可靠，操作方便。植物无病毒苗的培育5.鉴定方法：汁液涂抹法：从被鉴定植物上取1~3g幼叶→研碎→过滤→取滤液涂抹于指示植物的叶面上→保温15~25℃→接种后2~6d可见症状出现。嫁接接种法：以指示植物作砧木，被鉴定植物作接穗，常用劈接法。植物无病毒苗的培育二、抗血清鉴定法1.原理：植物病毒是由蛋白质和核酸组成的核蛋白，是一种较好的抗原，给动物注射后会产生抗体，抗体存在于血清之中称抗血清。不同病毒产生的抗血清有各自的特异性。用已知抗血清可以鉴定未知病毒的种类。植物无病毒苗的培育2.鉴定方法：抗原的制备→→抗血清的采收，分离→→把稀释的抗血清与未知的病毒植物的汁液在小试管内混合→→根据沉淀反应来鉴定病毒种类。植物无病毒苗的培育3.特点：特异性高（这种抗血清是高度专一性的试剂），测定速度快，一般几小时甚至几分钟就可以完成。所以抗血清法成为植物病毒鉴定中最有用的方法之一。植物无病毒苗的培育三、电子显微镜检查法病毒有一定的形态（球状、杆状、线状等）和大小（0.01~0.3um）。采用电子显微镜（分辨率0.0001um）可以直接观察病毒，检查出有无病毒存在，并鉴定病毒的种类。优点：灵敏度高，能在植物粗提取液中定量测定病毒。植物无病毒苗的培育第四节无病毒植物的利用一、植物病毒的浸染与传播（一）浸染植物自然孔口植物细胞微伤昆虫刺吸式口气植物无病毒苗的培育（二）传播介体传播：昆虫、线虫、螨接触传播：自然接触（风、雨）、汁液接种（嫁接）人为活动（修剪）、寄生植物（菟丝子）种子（豆科）植物无病毒苗的培育第四节无病毒植物的利用二、无病毒苗的保存繁殖无病毒植株并不是有额外的抗病性，它们有可能很快又被重新感染。所以一旦培育得到无病毒苗，就应很好地隔离与保存。这些原原种或原种材料保管得好可以保存利用5~10年。植物无病毒苗的培育•二、无病毒苗的保存繁殖•1、隔离保存：防虫网室•2、长期保存：•低温保存：培养基中，生长缓慢•超低温保存：液氮植物无病毒苗的利用二、无病毒苗的利用无病毒苗在生产中也要防止病毒的再感染。生产场所应隔离病毒感染途径，做好土壤消毒或防蚜等工作。在此种植区及种植规模小的地方，要较长时间才会感染。而在种植时间长、轮作及种植规模大的产地则在短期内就可以感染。植物无病毒苗的利用三、无病毒苗的效果无病毒苗可以表现出明显的优良效果。如草莓可增产20％~50％，植株结果多，单果重增加，上等果比例提高。菊花切花品种的脱毒株，表现出株高增加，切花数增多，花朵大，切花较重等特点。