实验四 凯氏定氮法测定蛋白质含量

实验一凯氏定氮法测定蛋白质含量凯氏定氮法是测定化合物或混合物中总氮量的一种方法。即在有催化剂的条件下，用浓硫酸消化样品将有机氮都转变成无机铵盐，然后在碱性条件下将铵盐转化为氨，随水蒸气馏出并为过量的酸液吸收，再以标准酸滴定，就可计算出样品中的氮量。由于蛋白质含氮量比较恒定，可由其氮量计算蛋白质含量，故此法是经典的蛋白质定量方法【目的】了解凯氏定氮法测定蛋白质含量的方法、意义及应用【原理】蛋白质是含氮的有机化合物。蛋白质与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后再以盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量计算出氮的含量，然后乘以相应的换算系数，即得蛋白质的含量。1.有机物中的铵根在强热和催化剂及浓H2SO4作用下，消化生成（NH4）2SO4，反应式为：2NH2+H2S04+2H+＝(NH4)2S04（其中CuSO4做催化剂）2.在凯氏定氮仪器中与碱作用，通过蒸馏释放出NH3，收集于H3BO3溶液中，反应式为:(NH4)2SO4+2NaOH＝2NH3↑+2H2O+Na2SO42NH3+4H3BO3＝(NH4)2B4O7+5H2O3.用已知浓度的HCl标准溶液滴定，根据HCl消耗的量计算出氮的含量，然后乘以相应的换算系数，即得蛋白质的含量，反应式为：(NH4)2B4O7+2HCl+5H2O＝2NH4Cl+4H3BO3【操作步骤】基本步骤如下：取样→消化→蒸馏→滴定→计算称取适量样品（约相当氮30mg～40mg）,移入干燥的消化管中，加入0.2g硫酸铜，6g硫酸钾及20ml浓硫酸，置于消化炉上小心加热，待内容物全部炭化，泡沫完全消失后，加大火力，并保持管内液体内微沸，至液体呈蓝绿色澄清透明后，再继续0.5h～1h。取下放冷待蒸馏用。（建议：消化炉温控时间及温度：1阶段选择温度范围280℃左右，时间为20分钟左右；2阶段选择温度范围450℃左右，待颜色变蓝绿色后继续加热0.5h～1h。1.样品消化NaOH、H2O注入管口，用橡胶管套如后分别置于NaOH、H2O盛器桶内，加液时按面板上相应开关，液体经电磁泵自动流入消化管内，注入毫升数视标尺所注位置而定。2.蒸馏蒸馏过程：（1）观察蒸发炉内水位，不能超过不锈钢电极（如果超过，要先排完水）。（2）关掉排水阀，打开加热电源，打开冷却水（自来水开关），打开绿色蒸汽开关（只需打开任意一组），然后，观察电流表；等电流表升到4A左右，关掉蒸汽开关。待其回到0A后再打开蒸汽开关。电流升到4A后再关掉，这样反复开关（0-10）左右直到蒸汽从塑料管内喷出，让其喷半分钟左右，关掉蒸汽开关，仪器进入正常的待机状态。（3）250ml三角接收瓶中加入2%H3BO350ml和2~3滴混合指示剂，将接收瓶套在蒸馏器的接收管上，并且让管口浸没在H3BO3溶液中。（4）把需要蒸馏的消化管固定在蒸馏器托物架上，然后按面板上NaOH、H2O开关，分别向消化管注入蒸馏水（10ml左右）及NaOH溶液（硫酸用量的5倍,约100ml），然后开启蒸汽开关，向试管内注入蒸汽、进行蒸馏。待接收瓶内液面高于150ml时将接收瓶下移，使接收管离开液面、用少量H2O冲洗出气口，继续蒸馏半分钟，然后取下接收瓶，待滴定用。甲基红乙醇溶液和溴甲酚绿乙醇配溶液指示剂，颜色由酒红色变成绿色。用0.05mol/LHCl滴定接收瓶内的溶液，滴定至(暗)灰色时为止，记下消耗HCL的毫升数。3.滴定按下列式子计算蛋白含量：X—样品中蛋白质的含量，%V1—样品消耗硫酸或盐酸标准液的体积，ml；V2—试剂空白消耗硫酸或盐酸标准液的体积，ml；N—硫酸或盐酸标准溶液当量浓度；0.014—1N硫酸或盐酸标准溶液1ml相当于氮克数；m—样品的质量（体积），g（ml）；F—蛋白质系数，按16%计算乘以6.25即为蛋白质。【结果及计算】100014.0)(21mFNVV蛋白质X%＝式中：测定范围：含氮在0.1～200mg测定品种：粮食、饲料、食品、乳制品、饮料、土壤、水、药物、沉淀物和化学品等。加入硫酸钾的作用为增加溶液的沸点，硫酸铜为催化剂，硫酸铜在蒸馏时作碱性反应的指示剂。混合指示剂在碱性溶液中呈绿色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈红色。如果没有溴甲酚绿，可单独使用0.1%甲基红乙醇溶液。