实验4 杀虫剂毒力测定

杀虫剂毒力测定吴顺凡农药科学系杀虫剂毒理与害虫抗药性监测课题组邮箱：[e-mail]；办公室：理科楼B8282014-4-18实验四基本概念•杀虫剂的生物测定：是度量杀虫剂对昆虫及螨类产生效应大小的农药生物测定方法。广义的说，就是利用生物（昆虫、螨）对杀虫剂的反应来鉴别某一种农药或化合物的生物活性的一种基本方法;•杀虫剂毒力测定主要内容：一是初步毒力测定，二是精密毒力测定;•初步毒力测定一般只判断药剂是否具有杀虫活性，不能确定化合物的毒力大小，也不能区分毒杀作用方式。•精密毒力测定是指在特定条件下衡量某种杀虫剂对某种昆虫毒力程度的一种作用方式。测定方法的选择•不同的杀虫剂对不同种类的害虫毒力程度各异，致毒作用方式也不相同，所以测定方法也各不相同；•杀虫剂的作用方式主要有：触杀、胃毒、内吸、熏蒸、驱避、引诱、拒食生长发育调节等；•一般说来，一种试验方法往往只局限杀虫作用方式的一个方面，因此在测定的方法的选择上也应根据杀虫剂的作用方式进行设计。主要内容•触杀毒力测定；•胃毒毒力测定；•熏蒸毒力测定；•内吸毒力测定。触杀毒力测定•杀虫剂的触杀作用是使药剂经昆虫表皮、感觉器及爪垫进入体内而产生的毒杀作用。杀虫剂触杀作用测定时应尽量避免药剂经口、气门等途径进入体内。•由于目前使用的杀虫剂大多数具有较强的触杀作用，因此杀虫剂的触杀毒力测定应用非常普遍。•触杀毒力的大小通常以LD50、LC50或KT50表示。•测定方法可分为整体处理法和局部处理法，常用的有点滴法，浸液法、药膜法、喷雾法、喷粉法及铜丝圈法等。•点滴法：因其施药量比较准确，易于操作而运用最为普遍。但点滴法一般要求供试昆虫数量较多，另外点滴部位及每头虫体点滴药液的体积和点滴散布面积要求相同，否则有明显影响；•喷雾法与喷粉法最接近田间情况，但喷雾（粉）时的压力是影响药剂喷洒是否均匀的重要原因，此外有时还不能完全消除胃毒毒力的可能；•药膜法比较接近实际防治情况，操作方便。多用来比较触杀速率，常用来测定药剂的击倒作用。以击倒中时（KT50）即击倒50%供试昆虫所需时间（分钟）来表示或测定杀虫剂对虫体很小（如蓟马、赤眼蜂等）的昆虫的毒力；•浸液法最为简单，但易产生胃毒毒力，对水生昆虫如孑孓以及水蚤等较为适宜。1.点滴法（Topicalapplication）毛细管微量点滴器构造示意图点滴法是在每头虫体的一定部位，点滴一定浓度及一定量的药液，用毛细管微量点滴器进行，适用于体型较小的昆虫如鳞翅目幼虫、蚜虫等。手动微量点滴仪/全自动微量点滴仪毛细管微量点滴器橡皮头支撑和固定部分毛细管毛细管微量点滴器由毛细管和1mL移液枪枪头两个部分构成毛细管为细钢管，内径约80微米，长0.5厘米。1mL移液枪枪头将毛细管固定。在枪头的另一端配上顶端有小孔的橡皮头，作为压出或吹出药液之用，毛细管容积可用同位素稀释法或快速薄层扫描仪（CS-920）来测定，点滴的药量一般在百分之几微升。点滴法实验步骤•预备试验：将配好的原药丙酮液，用毛细管微量点滴器点滴0.04微升药液于3龄棉铃虫幼虫胸部背面，每组处理2-3个浓度（参照已知同类杀虫剂，用丙酮配制低浓度和高浓度的药液，找出活虫组剂量和死虫组剂量）。•每浓度处理10头幼虫，经24～28小时（昆虫生长调节剂类药剂如虫酰肼所需时间还应长些）观察记载幼虫死、活情况。同时取50头昆虫点滴丙酮液作空白对照试验。•根据预备试验的结果，配制系列梯度浓度（等比系列）的药液，包括从最低浓度（活虫组的剂量）开始，到最高浓度（死亡组的剂量）止。将标准测试幼虫挑入具半人工饲料的培养皿（直径为5cm）中，每皿5或6头药剂用丙酮配制成等比系列浓度用0.04µl毛细管点滴器将药液滴于幼虫胸部背面点滴法操作每浓度点10头，重复3次，共30头，以丙酮为对照，处理幼虫饲养条件：温度27±1℃，光照周期16∶8(L∶D)h。点滴法操作•处理后幼虫单独饲养，分别记录处理剂量，根据处理剂量和毛细管点滴器的体积计算出每头幼虫的受药量(微克/头)。（字幕配音、放置培养箱视频）•整理试验结果，算出该药剂对供试昆虫的致死中量（LD50）。数据计量与分析（二）喷雾法和喷粉法用Potter喷雾塔直接对昆虫喷洒也是常用的触杀毒力测定方法。药液管1通气管2药液管载物台Potter喷雾塔构造Potter喷雾塔是一个文氏管（Venturitube）形的筒，即两端大中间细，雾点是直接往下喷的。喷筒采用文氏管形是为了沉降雾点的压力一致，使喷洒物表面沉积的药液量更为均匀，喷筒下面有一个平台，可放被喷洒物，此平台可上下调节，使喷筒下沿与平台间保持适当的距离（距离过大，液滴大部分四散；距离过小，造成返回气流）。整个装置放在一个大玻璃橱内，以保持温度和喷雾出口处的雾点不受外部气流的影响。喷雾采用有雾化器的喷头（靠气流雾化），在一定压力下，喷出的雾点可相当均匀稳定。Potter喷雾塔喷雾步骤•取培养皿18套，每套放3龄期大小相同的棉铃虫幼虫10头。•将配制好一定浓度的药液用吸管准确吸取2mL放入小瓶内。•将盛棉铃虫的培养皿放在喷雾台玻璃罩中心。•开动马达让药液在规定时间内（约30秒钟）将小瓶内药液全部喷出（试验前予先调节好压缩泵之压力达到1kg/cm2，并使每次喷药时压力保持一致）。•立即将喷过药的棉铃虫放在干净培养皿中，喂以人工饲料饲养，于2、24、48小时后记录棉铃虫死亡情况。胃毒毒力测定•胃毒毒力测定指通过试虫吞食带药食料，引起消化道中毒致死的反应，以测定胃毒毒力杀虫剂生物测定方法。•杀虫剂对昆虫的胃毒毒力测定方法因靶标昆虫的种类和杀虫剂的剂型不同而有所不同。•根据目标昆虫取食量及习性的差异可分为：无限取食法和定量取食法。•无限取食法：饲料混药喂虫法、培养基混药法、土壤混药法•定量取食法：叶片夹毒法、液点食喂法、口腔注射法毒饲料喂虫法1.将称好的药粉同谷物等饲料混合均匀，或将药剂溶于有机溶剂中（如丙酮），再将一定量的药液同食物混匀，待溶剂挥发后供试。2.接入标准一致试虫，每处理20～50头。3.然后置于适合该试虫生长的条件下（26℃～30℃）培养5d或7d后，检查死虫数。4.采用采用POLO-Plus软件计算毒力回归曲线b值及其标准误、LC50值及95%置信限。数据处理—机率值分析法•机率值分析法是传统的农药生物测定统计的最重要的基础方法；•在一个群体中，死亡率与剂量或浓度呈近乎正态分布，即稍偏离正态分布的曲线。把剂量转换成对数时，略有偏正的正态分布就变成了正态分布，并计算得到对数-死亡机率值线（也称毒力回归线）；•至今为止已开发了许多计算机程序软件，如SAS、POLO、DPS、SPSS、EPA、BA等。死亡率-几率值表1、剂量浓度转换成为对数使偏常态分布变成正态分布变成对称的“S”曲线。2、死亡率转换成机率值：（1）首先：5-7个剂量——死亡率的点来确定“S”型曲线，可以画出很多条适应这5~7点的曲线；（2）S曲线的特点是两端平缓，中间一段陡峭，因此在死亡率靠近50%时，剂量对数变化不大，图为剂量对数—死亡率机率指表。写成Y=bx+a的直线，从机率值为5处做一条与横坐标平行的直线与回归线相交的对数值，查反对数，即为致死中量。农药室内生物测定统计分析的步骤：POLO的使用•第一步在文本文档中输入数据（如图）•第二步打开POLO软件，并在软件中打开数据，如图，检查数据，确定退出后计算即可得到需要的毒力回归线。毒力曲线为Y=2.152x+4.152，致死中浓度(95%置信限)为2.479mg/L（1.523-4.156mg/L），卡方值为χ2=4.44，自由度为3。