荧光值所对应的PCR循环次数

实时荧光定量PCR技术原理、应用及实践(RealtimeQuantitativePCR)RealtimeQuantitativePCR主要内容Real-timeqPCR的定量原理2Real-timeqPCR的检测方法3Real-timeqPCR的基本概念1Real-timeqPCR的解析方法4PCR：基本原理Denaturation:94–96°CAnnealing:50–65°CExtension:70–75°C基本要素：•Template•Primers•DNApolymerase•dNTP,N=A,G,CorTPCR：基本原理•理想的PCR反应：N=N0*2n•实际的PCR反应：N=N0*(1+E)n•N0：初始模板量•N：第n次循环后的产物量•n：扩增反应的循环次数E：扩增效率S形曲线，具有平台效应与普通PCR的对比同一个样本进行96次重复传统PCR检测RealtimePCR检测RealtimePCR--起点检测：--起点量是样本中起始的DNA量--“加入了500个拷贝”--具有重现性，误差小传统PCR--终点检测：--终点产物量经过PCR放大的DNA量--“生成了500，0000，0000个拷贝”--不恒定，误差大传统PCR检测Real-timeqPCR激发光发射光--在PCR反应体系中加入荧光基团。--荧光基团在激发光的作用下，产生波长更长的发射光。--利用荧光信号的变化动态监测整个反应过程。荧光基团扩增曲线（primarycurve）扩增曲线：随着PCR反应的进行，扩增产物不断累积，荧光信号强度不断增加。每经过一个循环，收集一次荧光信号，通过荧光强度的变化监测扩增产物量的变化，从而得到扩增曲线图。纵坐标：Rn（荧光值）横坐标：cyclenumber（循环数）线性图对数图荧光阈值（threshold）基线(baseline)：一般以PCR反应前15个循环的荧光信号作为本底信号荧光阀值(threshold)：扩增曲线上人为设定的一个值--缺省设置：PCR反应前3-15个循环荧光本底信号标准偏差的10倍--手动设置：大于样本的荧光背景值Ct值(CycleThreshold)值：PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时，荧光值所对应的PCR循环次数。起始模板量基线阈值Ct值Ct值(CycleThreshold)值的特点：相同模板进行96次扩增，平台期DNA拷贝数波动很大，但Ct值相对固定；Ct值则极具重现性Ct值可以确定初始模板量？Rn=RB+X0(1+E)N*RS第n个循环的总信号=本底信号+起始DNA数目*PCR扩增效率*单位信号强度当循环次数n=Ct时RCt=RB+X0(1+E)Ct*RS两边同时取对数得:lg(RCt-RB)=lgX0+Ctlg(1+E)+lgRSCt=-lgX0/lg(1+E)+lg(RCt-RB)-lgRS/lg(1+E)Ct=-klgX0+blgX0与Ct值呈线性关系根据Ct值可以计算出样本中起始模板所含有的拷贝数起始拷贝数越多，Ct值越小。Rnvs.Cyclenumber--扩增曲线LogDNAvs.Ct--标准曲线.未知10410310610510210标准曲线(standardcurve)标准曲线分析--对已知或未知样本进行系列浓度梯度稀释y=-ax+b测定荧光定量PCR反应的有效性--线性的标准曲线：相关系数R2--扩增效率：扩增效率(E)=10-1/斜率-1标准曲线分析荧光定量PCR检测方法染料标记：SYBRGreenI探针标记：水解探针：TaqMan非水解探针：MolecularbeaconSYBRGreenI工作原理SYBRGreenI是一种与双链DNA小沟结合的荧光染料。SYBRGreenI只与双链DNA结合才能发出荧光。荧光信号与双链DNA分子数成正比，随着扩增产物增加而增加。荧光信号强度与反应体系中所有双链DNA分子成正比。5’3’5’3’SGSGSGSG5’3’5’3’SGSGSGSGEmissionExcitation--变性时，DNA双链分开，无荧光信号。--延伸结束时，采集荧光信号。SYBRGreenI工作原理SYBRGreenI优点：使用方便，成本低--仅需设计两个引物通用性好--对DNA模板没有选择性需要在反应结束时，对产物做融解曲线分析。缺点：SYBRGreen与所有双链DNA结合--引物二聚体或错误扩增产物造成假阳性--只能检测单一模板，无法进行多重检测将温度对荧光强度的变化求导。(-dI/dT)融解曲线(dissociationcurve)确认PCR反应产物的特异性对数图谱原始图谱融解曲线分析--非特异性产物--引物二聚体Taqman工作原理探针与靶序列配对（一段序列，两个基团，5’报告基团、3’淬灭基团）完整的探针，报告基团R发射的荧光被淬灭基团Q淬灭，没有荧光产生。聚合酶的5’外切酶活性报告基团R与淬灭基团Q分离，发射荧光。RQReporterQuencherRQ荧光信号强度与结合探针的DNA分子成正比。Taqman工作原理在退火过程中，探针与靶序列结合探针被Taq酶的5’-3’外切酶活性剪切成片断游离报告基团发出荧光在延伸过程中，探针部分与靶序列分离SYBRGreenI与Taqman对比Taqman特异性高--与特异靶序列结合对模板有选择性--可进行多重PCR反应SYBRGreenI使用方便，成本低--仅需设计两个引物通用性好--对DNA模板没有选择性荧光定量PCR解析方法绝对定量样本中核酸的量（拷贝数、微克）--检测某给定血液样本中的病毒颗粒数，有6000个拷贝相对定量不同样本中目的基因表达量的差异--肿瘤组织和正常组织相比某个基因的表达量mRNA改变了多少倍，改变了60倍绝对定量的步骤拷贝数计算对标准品进行梯度浓度稀释荧光定量PCR反应建立标准品未知样品Ct代入标准曲线确定拷贝数质粒提取OD值测定计算待测样本浓度/样本分子量/待测样本拷贝数标准品进行5-6个梯度稀释标准品稀释倍数为10绝对定量Sample--样本起始浓度与Ct呈线性关系，根据已知拷贝的标准品作出标准曲线。--根据未知样品的Ct值，推算出未知样本量。以标准品为标杆相对定量参照样本Calibrator用于比较结果的基准。相对定量特点选择内参基因内参基因beta-actin、GAPDH、18SrRNA等看家基因housekeepinggene在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定，受环境因素影响较小--文献检索--实验筛选内参基因--同样体积或重量的样本所来源的细胞数目不同。--RNA抽提、反转效率不同，操作中存在误差。对样本初始浓度差异进行均一化校正。2-ΔΔCt法成立条件：假设扩增效率为100%满足条件：1）内参基因和目标基因的扩增效率接近2）内参基因和目标基因的扩增效率均为90%-110%假设条件：内参基因和目标基因扩增效率差异大于5%1）优化实验条件，使扩增效率接近2）使用其他方法相对定量方法2-ΔΔCt法相对定量举例相对定量分析待测样品目的基因浓度待测样品内参基因浓度F=对照样品目的基因浓度对照样品内参基因浓度假设条件：内参基因和目标基因扩增效率不同优点：实验优化简单缺点：每一轮实验都必需做标准曲线双标准曲线法80%相对定量举例双标准曲线法实验流程SYBRGreen法实验流程样本处理RNA提取qPCR数据分析逆转录样本处理与RNA提取外界刺激–10min–可检测的表达改变样品离开定义环境–2min–裂解、固定细胞TRIzon（酚、异硫氰酸胍）裂解液（氰酸胍，异硫氰酸胍，SDS）液氮RNA保存液小心DNA污染！使用DNase阴性对照逆转录逆转录引物选择下游应用：是否检测其它基因？AbundantRNA的干扰：mRNAortotalRNA？检测灵敏度是否足够？引物特异性反应效率OligodT中低Randomhexmer低中Specificprimer高高RT-PCR一步法还是两步法？两步法:反转录和PCR扩增分两步进行。步骤多但灵活多样。cDNA可长期保留检测多个基因。便于反应优化。在工作的初期。一步法：反转录和PCR扩增在同一管内完成。简便、快捷但只做一个基因，一旦失败难以查找原因。在工作的成熟阶段。荧光定量PCR体系•Template•Primers•DNA聚合酶•BufferanddNTPs•Dye总原则与普通PCR相同：避免引物二聚体，避免二级结构扩增片段长度（80-300bp)推荐做跨intron设计引物设计原则第一对引物ct=21.36第二对引物ct=25.14第一对引物ct=21.36第二对引物ct=25.14Mastermix使用Mastermix有效降低系统误差--热启动酶Hotstar•化学修饰，低温下酶活抑制性强，热复活需10minFastHotstar•抗体修饰，热复活仅需几十秒--Buffer反应增强剂•减少模板二级结构影响•控制Mg2+浓度稳定剂--DyeRealSYBRGreenmixRealSupermixMastermix的优化新型荧光染料(SuperGreen)–激发、发射波长与SYBRGreen近似–对PCR反应抑制更轻微•可使用较高浓度(1uM,SYBRgreen0.3uM)更亮，灵敏度更高•较短的链延长时间–对小片段DNA和ssDNA结合更弱•减少背景，有效信号更强•与更强的信号协同，使溶解曲线峰更窄，适合于HRM分析–化学性质更稳定–致突变性与毒性更弱SYBRGreenSuperGreenMasterMixROXPassiveReference•不参与、不干扰PCR反应•恒定发射荧光信号•用于校正因信号检测器到各孔间光路不同而导致的系统误差。•有不同系统，需参照仪器要求选择。误差控制使用Mastermix配置预混体系设置生物学重复（不同个体）技术性重复（复孔）阳性和阴性对照实验环境控制试剂准备区核酸制备区反应液制备区荧光定量PCR反应区荧光定量PCR体系数据分析融解曲线：单一特异性产物扩增曲线：--Ct值大小--各复孔之间重复性--不同浓度梯度稀释的间隔性标准曲线：--R2＞0.980或∣r∣＞0.990--反应效率尽可能高：90%-110%--目的基因的扩增效率接近内参基因操作注意事项为避免加样误差，保证重复性，配制预混体系配制反应体系时，液体要缓慢加至管底，减少吹打低速离心，充分混匀，如有气泡短暂离心不要直接在八连管上进行标记避光保存，试剂分装避免反复冻融酒精擦拭移液器的吸头设置反应重复（至少二个）设置对照案例分析总体原则偶然因素--操作原因实验重复–生物学重复、技术性重复机器因素–仪器加样孔结合扩增曲线、融解曲线、标准曲线分析单孔和多孔分析内参基因和目的基因对比分析案例分析–扩增曲线曲线拐点清楚，特别是低浓度样本指数期明显。扩增曲线整体平行性好，基线平而无上扬现象。模板进行梯度稀释时，各浓度间隔性好。Ct15-35重复性扩增曲线--低浓度样本没有稀释好--重复性差，加样存在误差案例分析–扩增曲线案例分析–扩增曲线无信号或Ct值偏大内参基因和目的基因均无信号--RNA降解内参基因和目的基因均偏大--模板量低--对未知浓度的样品应从稀释最高浓度做起内参基因正常，而目的基因偏大或无信号--引物设计--目的基因表达量低案例分析Q．内参基因与目的基因的Ct值之差在多大范围内可以接受？A：--在使用2-△△Ct法计算的前提是，公式成立的条件是内参基因和目的基因的扩增效率相接近并且足够高，在90%-110%之间，因此内参基因与目的基因的差值是可以接受的。--内参基因和目的基因的Ct值在15-35以内，并且重复管之间的重复性很好，这样的数据都是可以接受的。案例分析–扩增曲线扩增曲线不平滑--样本浓度太低--原始信号弱关闭ROX校正信号案例分析–扩增曲线扩增曲线很早扬起